低氧条件下培养的细胞衍生的胞外囊泡及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种从条件培养基(CCM)组合物中产生胞外囊泡组合物的方法。所述方法包括在低氧条件下于体外生物相容性表面上培养细胞。所述培养方法同时产生了可溶性(CCM)和不可溶性组分。胞外囊泡来源于低氧条件下培养的细胞所产生的可溶性组分(CCM)，并可以用于多种医学和治疗应用。学和治疗应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】低氧条件下培养的细胞衍生的胞外囊泡及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求于2018年1月30日提交的美国临时申请第62/623,851号的优先权权益，其全部内容通过引用整体并入本文。


[0003]本专利技术通常涉及胞外囊泡组合物的产生及用途，更具体地，涉及通过在低氧条件下于适当生长培养基中培养细胞获得的胞外囊泡组合物。

技术介绍

[0004]胞外基质(ECM)是在哺乳动物组织内体内发现的包围和支持细胞的复杂结构实体。ECM通常被称为结缔组织。ECM主要由三大类生物分子构成，所述生物分子包括结构蛋白(如胶原蛋白和弹性蛋白)、特化蛋白(如原纤维蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)和蛋白聚糖。
[0005]ECM组合物的体外生长及其在各种治疗和医学应用中的用途已在本领域进行了描述。这类ECM组合物的一种治疗应用包括治疗和修复软组织和皮肤缺损，如皱纹和瘢痕。
[0006]由缺损(如痤疮、手术瘢痕或老化)引起的软组织缺损的修复或增强已被证明非常困难。许多材料已被用于矫正软组织缺损，并取得了不同程度的成功，然而，还没有一种材料是完全安全有效的。例如，硅会引起各种生理和临床问题，包括长期副作用，如结节、复发性蜂窝织炎和皮肤溃疡。
[0007]胶原蛋白组合物也被用作软组织增强的可注射材料。胶原蛋白是结缔组织的主要蛋白和哺乳动物体内含量最丰富的蛋白，约占总蛋白含量的25％。目前文献中描述了28种胶原蛋白(例如，详细列表参见下表1和表2)。然而，体内超过90％的胶原蛋白是胶原蛋白I、II、III和IV。
[0008]不同的胶原蛋白材料已被用于治疗软组织缺损，如重组可注射牛胶原蛋白、交联胶原蛋白或其他异种胶原蛋白。然而，这类胶原蛋白存在几个问题。一个常见问题包括生产植入物材料以去除潜在免疫原性物质从而避免受试者过敏反应非常复杂且成本较高。此外，使用这类胶原蛋白的治疗尚未被证明具有长期持久性。
[0009]还描述了可以用于软组织修复或增强的其他材料，如水凝胶中的生物相容性陶瓷颗粒(美国专利第5,204,382号)、热塑性和/或热固性材料(美国专利第5,278,202号)和乳酸基聚合物混合物(美国专利第4,235,312号)。此外，还描述了天然分泌ECM组合物的用途(美国专利第6,284,284号)。然而，这类材料都被证明有局限性。
[0010]因此，软组织修复和增强需要新的材料，以克服之前材料的缺陷。需要提供一种安全、可注射、持久、生物可吸收的软组织修复和增强材料。
[0011]体外培养的ECM组合物可以附加地用于治疗受损组织，如受损心肌和相关组织。所述组合物可以用作植入式器械(如支架)上的植入物或生物涂层；用于促进器官(如心脏和相关组织)血管化的人工血管；以及用于疝修补、盆底修补、伤口修补和肩袖修补(如补片等)的器械。
[0012]冠心病(CHD)，也称为冠状动脉疾病(CAD)、缺血性心脏病和动脉粥样硬化性心脏病，特征为供应心脏血液和氧气的小血管狭窄。冠心病通常是由称为动脉粥样硬化的病况引起的，当脂肪物质和斑块聚集在动脉壁上导致动脉狭窄时，就会发生动脉粥样硬化。由于冠状动脉狭窄，流向心脏的血流可能减慢或停止，引起胸痛(稳定型心绞痛)、气短、心脏病发作等症状。
[0013]在美国，冠心病(CHD)是男性和女性死亡的主要原因。根据美国心脏协会的数据，超过1500万人患有一些形式的病况。虽然冠心病的症状和征象在疾病晚期很明显，但随着疾病进展，在心脏病突然发作之前，大多数冠心病患者几十年来并没有疾病征兆。所述疾病是猝死的最常见原因，也是20岁以上男女最常见的死亡原因。根据美国目前的趋势，40岁健康男性中有一半在未来会得CHD，而40岁健康女性中也有三分之一在未来会得CHD。
[0014]目前改善患病或其他受损心脏血流的方法涉及侵入性手术技术，如冠状动脉旁路移植术、血管成形术和动脉内膜切除术。这类手术自然涉及术中和术后的高度固有风险，并通常仅为心肌缺血提供临时补救措施。因此，需要新的治疗选择来增加目前可用的治疗CHD和相关症状技术的成功率。
[0015]体外培养的ECM组合物还可以用于修复和/或再生受损的细胞或组织，如软骨或骨软骨细胞。骨软骨组织是与骨或软骨相关或含有骨或软骨的任何组织。本专利技术的组合物可以用于治疗骨软骨缺损，如退行性结缔组织疾病，如类风湿和/或骨关节炎，以及由于创伤导致软骨缺损的患者的缺损。
[0016]目前修复骨软骨缺损的尝试包括将人软骨细胞植入生物相容性和生物可降解的水凝胶移植物中，以试图提高恢复关节软骨病变的可能性。此外，已描述了在藻酸盐珠或含多硫酸化盐藻酸盐的基质中培养软骨细胞的技术可以生成透明样软骨组织。然而，通过植入人自体软骨细胞修复关节软骨的软骨内损伤的尝试收效甚微。因此，需要新的治疗选择来增加目前可用的治疗骨软骨缺损技术的成功率。
[0017]体外培养的ECM组合物在组织培养系统中也可以用于产生工程组织植入物。组织工程领域涉及利用细胞培养技术生成新的生物组织或修复受损组织。部分由干细胞革命推动的组织工程技术为创伤或退行性疾病治疗后的组织再生和替代提供了希望。其也可以用于整容手术。
[0018]组织工程技术可以使用多种细胞类型和培养技术，以用于同时生成自体和异体组织或细胞。在创建自体植入物时，可以采集供体组织并分离成单个细胞，随后在基质上贴壁和培养，以在所述功能组织的预期部位进行植入。许多分离的细胞类型可以使用细胞培养技术在体外扩增，然而，锚定依赖细胞需要特定的环境，通常包括三维支架的存在，以作为生长的模板。
[0019]目前的组织工程技术一般提供人工植入物。成功的细胞移植治疗取决于为体外和体内组织培养开发提供合适的基质。因此，仅含有天然材料并适用于植入的ECM的发展将具有更多内源性组织的特征。因此，天然ECM材料的产生是组织工程领域的一个持续挑战。
[0020]长期以来，已知细胞在凋亡过程中会将囊泡释放到胞外环境中。然而，直到最近才意识到健康细胞也将囊泡释放到胞外环境。胞外囊泡(ECV)或外泌体是40-100nm细胞来源的膜囊泡，存在于许多和几乎所有的真核液体中，包括血液、尿液和细胞培养物的培养基。ECV含有其起源细胞的各种分子成分，包括蛋白和RNA。ECV可以在细胞间信号传导中发挥作
用，具体来说，因为ECV可以以与远离其起源细胞的细胞结合并将其内容物释放到细胞中，所以它们可能影响受体细胞中的过程。ECV的分离和检测已被证明是复杂的。由于体液的复杂性，ECV与细胞和相似大小颗粒的物理分离具有挑战性。

技术实现思路

[0021]本专利技术的部分基于开创性的发现，即在刺激早期胚胎环境(例如，低氧和重力降低)的条件下在表面(例如，二维或三维)上培养的细胞产生具有胎儿特性的ECM组合物和条件培养基(CCM)组合物。在低氧条件下在含有一种或多种胚胎蛋白的表面上培养细胞产生的ECM组合物具有多种有益的应用。研究还发现，在低氧条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9、CD63和/或CD81阳性胞外囊泡(ECV)。2.如权利要求1所述的ECV，其中所述ECV通过以下产生：在1-5％氧气的低氧条件下，于合适生长培养基中在微载体珠或三维表面上培养成纤维细胞至少2周，从而产生多能干细胞，所述多能干细胞产生并分泌ECV到所述培养基中；并收集所述ECV。3.如权利要求1所述的ECV，其中所述Wnt蛋白选自Wnt3a、Wnt7a和/或Wnt7b。4.一种产生至少包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白的ECV的方法，所述方法包含：在1-5％氧气的低氧条件下，于合适生长培养基中在微载体珠或三维表面上培养成纤维细胞至少2周，从而产生多能干细胞，其中所述多能干细胞在所述培养基中产生并分泌胞外囊泡...

【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：希斯托金公司，
类型：发明
国别省市：