一种通过光调控精确检测生物体内H2O2的荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种可通过光调控精确检测生物体内H2O2的荧光探针及其制备方法和应用，属于有机荧光探针领域。所述的荧光探针基于嘧啶基染料，为UFPS

【技术实现步骤摘要】
一种通过光调控精确检测生物体内H2O2的荧光探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种基于嘧啶基染料，可通过光调控精确检测生物体 内H2O2的荧光探针，属于有机荧光探针领域。

技术介绍

[0002]过氧化氢(H2O2)是活性氧(ROS)中一种非常典型的物质，几 乎存在于所有细胞中，是氧代谢的重要产物，在调节多种细胞功能中 起着至关重要的作用。与ROS家族的其他物质(如超氧物或羟基自由 基)不同，H2O2可以自由扩散，结构相对稳定，寿命长。生物体内的 H2O2通常来自线粒体、过氧化物酶体和胞浆酶，其中线粒体是H2O2的主要生理来源之一。
[0003]活性氧物种(ROS)的大量增加会导致各种生物分子的结构性氧 化损伤，这些生物分子对细胞的结构完整性至关重要，包括脂质、DNA 和蛋白质。活性氧引起的这种氧化损伤被称为“氧化应激”，并已被证 明与多种生物分子有关在癌症、糖尿病、肥胖症和中风等疾病中。中 枢神经系统(CNS)因其高耗氧量而对氧化应激特别敏感，过量产生 ROS可能导致神经元功能障碍或死亡，如阿尔茨海默氏症(AD)、帕 金森氏病(PD)和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和其他神经退行性疾 病。
[0004]因此，开发实时、无创的ROS特异性检测工具对于研究氧化应激 相关疾病的发病机制尤为重要。为了解决这一问题，亟需研发一种可 以高效、精准检测H2O2的荧光探针。

技术实现思路

[0005]本专利技术利用嘧啶基染料DMe的光学及生物性质，在其结构上引 入了H2O2特异性识别基团硼酸酯结构，进而达到精准检测活细胞内 H2O2的目的，亦可用于检测野生型及帕金森病(Parkinson
’
s disease, PD)模型果蝇脑组织中的H2O2。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：一种通过光调控精确检测生物体内 H2O2的荧光探针，所述的荧光探针为UFPS-1探针，UFPS-1荧光探针 结构如图(Ⅰ)所示：
[0007][0008]优选的，取25mL的圆底烧瓶，将嘧啶基染料DMe用10mL吡 啶溶解，逐滴加入三氯氧磷，搅拌2小时直至溶液澄清，随后放入冷 井-40℃环境，使用吡啶溶解4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯，随后取出 并常温搅拌3小时，将反应体系放入-20℃的环境，用水淬灭反应， 乙酸乙酯萃取，洗涤有机相并用无水硫酸钠干燥，通过硅胶层析法分 离纯化得到目标产物UFPS-1荧光探针。
[0009]优选的，所述的嘧啶基染料DMe、三氯氧磷与4-(羟甲基)苯硼酸 频哪醇酯的摩尔比为1：3：1。
[0010]优选的，所述的嘧啶基染料DMe的制备方法如下：50mL圆底 烧瓶加入20mL乙醇和对二甲氨基苯甲醛，超声溶解固体，搅拌加 入浓盐酸5.6mL，95℃回流24h。反应结束后将溶液倒入冰水中， 加入碳酸氢钠中和；用CH2Cl2萃取两次后无水硫酸钠干燥有机相，除 去无水硫酸钠和有机溶剂，用硅胶层析法得到染料DMe。
[0011]优选的，本专利技术精确检测生物体内H2O2的荧光探针的制备反应 式如下：
[0012][0013]本专利技术采用的另一技术方案是：所述的通过光调控精确检测生物 体内H2O2的荧光探针的应用，用于生理体系中精确检测生物体内的 H2O2的试剂制备。
[0014]优选的，所述试剂在细胞体系中通过光调控精确检测生物体内的 H2O2而避免来自细胞中其他离子和氨基酸的干扰的应用。
[0015]优选的，所述生物体内包括活细胞及动物组织为HepG2细胞株、 LO2细胞株、Parkin Null型及Wild type型果蝇大脑。
[0016]有益效果：
[0017]本专利技术的荧光探针具有近红外发射的优点，因此具有组织穿透能 力强、光损伤弱
和受组织自发荧光影响弱等优点，且反应后荧光量子 产率显著增高。体外实验研究表明，探针与H2O2反应速度快。在生 物条件(pH 7.4)下,探针稳定，且对H2O2具有较高的灵敏度和选择 性，不受其他离子和氨基酸的干扰。生物实验研究表明，探针对癌细 胞及普通体细胞毒性均较低，且可以检测细胞中外源和内源性H2O2的水平。进一步将探针应用于PD果蝇脑模型中，实验证明探针可以 直观地显示出PD模型中内源性H2O2水平。
附图说明
[0018]图1-a,1-b,1-c分别是探针UFPS-1的氢谱、碳谱、质谱数据。
[0019]图2为2μM探针UFPS-1在PBS溶液(含0.2％DMSO和0.02％Triton) 中，与0-200倍当量的H2O2反应2小时的吸收光谱图。
[0020]图3为2μM探针UFPS-1在PBS溶液(含0.2％DMSO和0.02％Triton) 中，与0-200倍当量的H2O2反应2小时的发射光谱图。
[0021]图4为常见活性氧/活性氮物质在120分钟内对探针UFPS-1的影响(纵 坐标为实时荧光强度与初始荧光强度的比值)。
[0022]图5为探针UFPS-1对42种不同离子及氨基酸的选择性。
[0023]图6为不同pH条件对探针UFPS-1的影响。
[0024]图7为不同浓度UFPS-1作用24h后，HepG-2细胞存活率(MTT法)。
[0025]图8为不同浓度UFPS-1作用24h后，LO2细胞存活率(MTT法)。
[0026]图9-a为UFPS-1对HepG2细胞外源性/内源性H2O2水平的荧光成像。 比例尺＝10μm；图9-b为图9-a的相对荧光强度(1-5)。统计分析采 用t检验。***P<0.001。
[0027]图10-a为UFPS-1在室温下对野生型(3)和Parkin-Null(4)果蝇大 脑进行共焦荧光显微镜成像。图10-b为图10-a相对荧光强度(1-6)。 统计分析采用t检验。***P<0.001，**P<0.01。
具体实施方式
[0028]实施例1
[0029]一种通过光调控精确检测生物体内H2O2的荧光探针的制备方法 如下：
[0030]1、嘧啶基染料DMe的制备
[0031]50mL圆底烧瓶加入20mL乙醇和对二甲氨基苯甲醛(1.83g， 12.25mmol)超声溶解固体，搅拌加入浓盐酸5.6mL，95℃回流24h。 反应结束后将溶液倒入冰水中，加入碳酸氢钠中和。CH2Cl2萃取两次 后无水硫酸钠干燥有机相，除去无水硫酸钠和有机溶剂，用硅胶层析 法得到深红色固体DMe。
[0032]1H NMR(500MHz,DMSO-d6,ppm):δ＝7.74(d,J＝16.25Hz,2H), 7.49(d,J＝8.35Hz,4H),6.77(d,J＝8.55Hz,4H),6.74(s,1H),6.71(d, J＝16.2Hz,2H),2.99(s,12H).
[0033]2、探针UFPS-1的制备
[0034]取25mL的圆底烧瓶，加入10mL吡啶溶解DMe(116mg，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过光调控精确检测生物体内H2O2的荧光探针，其特征在于：所述的荧光探针为UFPS-1探针，UFPS-1荧光探针结构如图(Ⅰ)所示：2.根据权利要求1所述的通过光调控精确检测生物体内H2O2的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：将嘧啶基染料DMe用10mL吡啶溶解，逐滴加入三氯氧磷，搅拌2小时直至溶液澄清，随后放入冷井-40℃环境，使用吡啶溶解4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯，随后取出并常温搅拌3小时，将反应体系放入-20℃的环境，用水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，洗涤有机相并用无水硫酸钠干燥，通过硅胶层析法分离纯化得到目标产物UFPS-1荧光探针。3.根据权利要求2所述的通过光调控精确检测生物体内H2O2的荧光探针的制备方法，，其特征在于：所述的嘧啶基染料DMe、三氯氧磷与4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1：3：1。4.根据权利要求2所述的通过光调控精确检测生物体内H2O2的荧光探针的制备方法，，其特征在于：所述的嘧啶基染料DMe的制备方法如下：50mL圆底烧瓶加入20mL乙醇和对二甲氨基苯甲醛，超...

【专利技术属性】
技术研发人员：张承武，陆瑶，仇兴汉，李林，王延宾，黄维，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：