杂交瘤细胞株9C1、PLGF-1单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了杂交瘤细胞株9C1、PLGF

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株9C1、PLGF-1单克隆抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及杂交瘤细胞株9C1、PLGF-1单克隆抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]在子宫螺旋动脉重塑过程中，合体滋养层细胞分泌胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF-1)，促进血管生成，改善血流灌注，正常妊娠时，健康孕妇血清在孕5～15周PLGF-1水平低，15-26周PLGF-1表达迅速增加，在妊娠28～30周达高峰，之后胎盘逐渐成熟老化，PLGF-1水平也随之明显下降。胎盘形成缺陷时PLGF-1水平显著降低，导致胎盘发育不良，引起胎盘功能不全，难以给胎儿提供充分的养分和氧气，可能引发一系列的疾病，诸如流产、妊娠期高血压、先兆子痫(preeclampsia，PE)、胎儿生长受限和早产等，情况严重时还会引起相关并发症，诸如死胎、子痫、HELLP综合征和胎盘早剥等，与传统诊断方式相比，PLGF-1浓度值的下降比高血压和蛋白尿的出现要早9～11周，可在疾病发病前五周内浓度有较集中的体现。
[0003]目前检测PLGF-1的方法有酶联免疫法、使用微流控的荧光免疫法，然而PLGF-1浓度在血清中含量较低，对相应的检测抗体要求高。因而开发一种快速、灵敏的抗人胎盘生长因子-1抗体及发展一种有望用于临床诊断的抗人胎盘生长因子-1抗体迫在眉睫。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供杂交瘤细胞株9C1，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2019年9月11日，保藏编号为：CCTCC NO：C2019216。
[0005]本专利技术的又一目的是提供一种抗人胎盘生长因子-1的单克隆抗体，即，PLGF-1单克隆抗体，所述PLGF-1单克隆抗体是由保藏编号为：CCTCC NO：C2019216的杂交瘤细胞株9C1分泌，其重链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型。
[0006]本专利技术的另一目的是提供上述杂交瘤细胞株9C1在制备PLGF-1单克隆抗体中的应用。
[0007]本专利技术的另一目的是提供一种检测试剂，所述检测试剂包括上述的PLGF-1单克隆抗体。
[0008]本专利技术的另一目的是提供上述抗人胎盘生长因子-1的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0009](1)抗原制备：利用大肠杆菌表达获得PLGF-1重组蛋白；
[0010](2)小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以步骤(1)获得的PLGF-1重组蛋白为抗原对所选小鼠进行免疫；
[0011](3)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：培养步骤(2)中至少一只小鼠骨髓瘤细胞SP2/0
并使其生长状态保持良好；
[0012](4)细胞融合：将步骤(2)中小鼠的脾脏淋巴细胞与步骤(3)中小鼠骨髓瘤细胞SP2/0采用聚乙二醇细胞融合法进行融合，融合后的细胞以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞进行饲养培养；
[0013](5)杂交瘤细胞的筛选：培养步骤(4)所得培养物，采集细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性杂交瘤细胞；
[0014](6)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆步骤(5)所选定的阳性杂交瘤细胞，反复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％；
[0015](7)诱生腹水：给步骤(2)所得至少一只BALB/C小鼠腹腔注射降植烷，并接种步骤(6)所得阳性杂交瘤细胞，收集腹水离心；
[0016](8)单克隆抗体的纯化：纯化步骤(7)所收集腹水中的单克隆抗体。
[0017]在一种可实现的方式中，所述方法具体包括：
[0018](1)抗原制备：利用大肠杆菌表达获得所述PLGF-1重组蛋白，其中，所述PLGF-1重组蛋白含有132个氨基酸，其GenBank登录号为P49763.2，可选地，该蛋白的制备由上海普欣生物技术有限公司完成；
[0019](2)小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以步骤(1)获得的PLGF-1重组蛋白为抗原对小鼠进行免疫，每只小鼠以100ug的抗原肽混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次；第3次加强免疫3天后用于融合；
[0020](3)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；
[0021](4)细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％小牛血清的HAT培养基培养一天，将步骤(2)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞，收集步骤(3)中的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合，融合后的细胞用细胞培养基稀释，接种至饲养细胞培养板，置37℃5％CO2培养箱中培养；
[0022](5)杂交瘤细胞的筛选：培养上述培养物，在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆；
[0023](6)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆阳性的杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔细胞培养板，使每孔只有一个细胞生长；形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免疫吸附检测(ELISA)，筛选和鉴定阳性克隆；重复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％；
[0024](7)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前1周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种生长良好的5
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106个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价；
[0025](8)单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。
[0026]可选地，所述方法在步骤(8)之后还包括：(9)单克隆抗体的亚型鉴定。
[0027]进一步地，所述步骤(9)具体可以为采用Serotec公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析，将纯化的单抗作适当稀释后进行检测。
[0028]更进一步地，在步骤(9)的操作严格按试剂盒说明书进行，杂交瘤细胞株9C1分泌
的单克隆抗体为IgG1、κ型，与抗PLGF-1抗原具有高的特异性和灵敏性。
[0029]本专利技术具有有益效果：本专利技术杂交瘤细胞9C1，分泌PLGF-1单克隆抗体高效稳定，经液氮冻存复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退；本专利技术PLGF-1单克隆抗体与PLGF-1抗原具有高的特异性和灵敏性，可用于制备对临床和实验室定性和定量检测的检测试剂，检测结果为临床提供实验室诊断依据，具有良好的应用前景。
附图说明
[0030]图1为重组人PLGF-1(rHuPLGF-1)电泳图，其中，1是蛋白Marker，2和3为rHuPLGF-1蛋白。
[0031]图2为间接ELISA法检测PLGF-1单克隆抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株9C1，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C2019216。2.PLGF-1单克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1所述的保藏编号为：CCTCC NO：C2019216的杂交瘤细胞株9C1产生。3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株9C1在制备PLGF-1单克隆抗体中的应用。4.权利要求2所述的PLGF-1单克隆抗体在制备抗人胎盘生长因子-1检测试剂中的应用。5.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括权利要求2所述的PLGF-1单克隆抗体。6.一种制备权利要求2所述的PLGF-1单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)抗原制备：利用大肠杆菌表达获得PLGF-1重组蛋白；(2)小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以步骤(1)获得的PLGF-1重组蛋白为抗原对所选小鼠进行免疫；(3)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：培养步骤(2)中至少一只小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其生长状态保持良好；(4)细胞融合：将步骤(2)中小鼠的脾脏淋巴细胞与步骤(3)中小鼠骨髓瘤细胞SP2/0采用聚乙二醇细胞融合法进行融合，融合后的细胞以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞进行饲养培养；(5)杂交瘤细胞的筛选：培养步骤(4)所得培养物，采集细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性杂交瘤细胞；(6)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆步骤(5)所选定的阳性杂交瘤细胞，反复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％；(7)诱生腹水：给步骤(2)所得至少一只BALB/C小鼠腹腔注射降植烷，并接种步骤(6)所得阳性杂交瘤细胞，收集腹水离心；(8)单克隆抗体的纯化：纯化步骤(7)所收集腹水中的单克隆抗体。7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)抗原制备：利用大肠杆菌表达获得所述PLGF-1重组蛋白，其中，所述PLGF-1重组蛋白含有132个氨基酸，其GenBank登录号为P49763.2；(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：周义正，张伟，
申请(专利权)人：宁波奥丞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：