一种表达载体及其在制备转基因棕色棉花中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达载体及其在制备转基因棕色棉花中的应用，属于棉花基因工程技术领域，本发明专利技术提供了一种表达载体Gb_expa2::Gh_RE，其中包含如序列表SEQ ID NO.1所示的红株突变体基因Gh_RE和如序列表SEQ ID NO.2所示的启动子Gb_expa2，并将该表达载体导入到棉花的宿主细胞中，从而在伸长期的棉花纤维中高量表达Gh_RE，在发育的纤维中产生花青素积累，并最终在成熟的棉花纤维中产生明显的色素积累，表现出明显的棕色，即本发明专利技术通过基因工程技术得到了一种新的棉花棕色纤维材料，并为在纤维中产生色素积累提供了新思路。纤维中产生色素积累提供了新思路。纤维中产生色素积累提供了新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种表达载体及其在制备转基因棕色棉花中的应用


[0001]本专利技术属于棉花基因工程
，具体涉及一种表达载体及其在制备转基因棕色棉花中的应用。

技术介绍

[0002]棉花是重要的经济作物，在纺织工业中有着举足轻重的作用，与人民生活息息相关，有重要的研究意义。叶色突变体因为表型明显，受到育种家们的关注，并被尝试用于作物选择育种。棉花中的红株突变体因为有一定的抗虫性，一直受到研究者们的青睐。如何更好利用红株基因还有待更多的尝试。
[0003]彩色棉是一种能在纤维中积累色素并表现出一定色彩的棉花特殊材料，能减少漂白与染色加工，避免一些残留的化学试剂对皮肤的不友好。随着人们绿色消费观念的增强，天然的彩色棉产品会受到更多人的喜爱，彩色棉也会有更好的发展市场与前景。
[0004]叶色突变与彩色棉形成的主要原因都是花青素在特定部位的过量积累，有趣的是，红株突变体植株的茎叶在全生育期都表型出明显的红紫色，但棉絮却是正常的白色。而彩色棉材料除了棉絮表现出特殊色彩，植株本身却和正常棉花植株相差无几。棕色棉是目前最常见、应用也最广的彩色棉。Wen等(2017)收集了100份棕色棉材料，并通过连锁和关联作图揭示了棕色棉的遗传基础。Yan等(2018)通过在棉花纤维次生壁增厚期上调表达GhTT2-3A，使纤维表现出棕色。
[0005]红株突变体来自于陆地棉鄂棉22(E22)和海岛棉3-79杂交F1的回交后代，通过基因定位、表达量检测、基因克隆以及功能验证，找到红株内源突变体基因，一个R2R3型MYB转录因子，将其命名为Gh_RE，在棉花三代参考基因组中(Wang,M.,Tu,L.,Yuan,D.et al.Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons,Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense.Nat Genet 51,224-229.2019)，基因ID为Ghir_D07G008560。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对现有技术中彩色棉种质稀少，并且颜色单一的缺陷，将红株内源突变体基因Gh_RE的编码区序列与包含有启动子Gb_expa2的载体连接得到表达载体Gb_expa2::Gh_RE，将其导入棉花宿主细胞，使Gh_RE基因在纤维伸长期的纤维中高量表达，使最终的成熟纤维产生色素积累，从而制备得到了一种转基因棕色棉新品种。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种表达载体Gb_expa2::Gh_RE，包含红株突变体基因Gh_RE和启动子Gb_expa2，其中所述红株突变体基因Gh_RE的序列如序列表SEQ ID NO.1所示，所述启动子Gb_expa2的序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供了一种遗传工程菌，所述遗传工程菌包含上述表达载体。
[0010]本专利技术还提供了所述表达载体或所述遗传工程菌在制备转基因棕色棉花中的应
用。
[0011]本专利技术还提供了所述表达载体的构建方法，包括：以红株突变体的cDNA为模板，扩增得到SEQ ID NO.1所示的序列，并与包含有启动子Gb_expa2的载体连接，即得到所述表达载体。
[0012]进一步的，以红株突变体的cDNA为模板，以SEQ ID NO.3-4所述的序列为引物，扩增得到SEQ ID NO.1所示的序列。
[0013]本专利技术还提供了一种转基因棕色棉花的制备方法，包括：将上述表达载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入棉花宿主细胞，诱导宿主细胞表达即得所述转基因棕色棉花。
[0014]进一步的，所述方法包括：
[0015]步骤1、按上述构建方法得到表达载体，并将表达载体导入到农杆菌中，并用农杆菌活化培养基悬浮得到农杆菌菌液；
[0016]步骤2、选取棉花种子剥去种皮，灭菌后接种于无菌苗培养基中，得到无菌苗下胚轴；
[0017]步骤3、将步骤2得到的无菌苗下胚轴切成小段后接种于步骤1的农杆菌菌液中进行侵染，接着转移到无菌滤纸上吸干残留菌液；
[0018]步骤4、将步骤3得到的侵染后的无菌苗下胚轴接种于共培养培养基中，于21℃下共培养48h；；
[0019]步骤5、接着转移至选择培养基中培养，获得胚性愈伤组织，然后转入分化培养基中培养，获得转基因幼苗后转移至生根培养基上诱导生根，直至获得完整的转基因植株。
[0020]进一步的，所述方法还包括：转基因植株的阳性鉴定，即提取步骤5得到的转基因植株的基因组DNA，并以序列表SEQ ID NO.5-6所示序列作为引物，进行PCR扩增和鉴定。
[0021]进一步的，所述方法还包括：Gh_RE基因表达量的检测，即提取步骤5得到的转基因植株的总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，以序列表SEQ ID NO.7-8所示序列作为引物进行PCR扩增和检测。
[0022]进一步的，步骤1中所述农杆菌活化培养基包括：胰化蛋白胨、NaCl、MgSO4、KH2PO4、甘露醇和甘氨酸；
[0023]步骤2中所述无菌苗培养基包括：1/2MS培养基、葡萄糖和Phytagel；
[0024]步骤4中所述共培养培养基包括：MSB培养基、2,4-D、激动素、乙酰丁香酮、葡萄糖和Phytagel；
[0025]步骤5中所述选择培养基包括：MSB培养基、2,4-D、激动素、葡萄糖、Phytagel、卡那霉素、头孢霉素；
[0026]步骤5中所述分化培养基包括：不含有NH4NO3且KNO3含量加倍的MSB培养基、吲哚丁酸、激动素、葡萄糖、谷氨酰胺、天冬酰胺和Phytagel；
[0027]步骤5中所述生根培养基包括：MSB培养基、谷氨酰胺、天冬酰胺和Phytagel。
[0028]进一步的，所述步骤5中转移至选择培养基后，每一个月继代培养一次直至获得胚性愈伤组织；然后转入分化培养基中培养，每一个月继代培养一次直至获得转基因幼苗。
[0029]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术通过将Gh_RE基因的cDNA序列构建到包含有启动子Gb_expa2的纤维特异启动子载体上，得到一种表达载体，并将该表达载体
导入到棉花的宿主细胞中，从而在伸长期(5-10天)的棉花纤维中高量表达Gh_RE，在发育的纤维中产生花青素积累，并最终在成熟的棉花纤维中产生明显的色素积累，表现出明显的棕色。本专利技术制备得到了新的棉花棕色纤维材料，同时本专利技术中制备转基因棕色棉花的方法为在纤维中产生色素积累提供了新思路。
附图说明
[0030]图1为本专利技术实施例1构建的表达载体Gb_expa2::Gh_RE的结构示意图；
[0031]图2为本专利技术实施例2中表达载体Gb_expa2::Gh_RE遗传转化的过程图；
[0032]图3为本专利技术实施例3中转基因植株阳性鉴定的PCR结果图，其中前三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含红株突变体基因Gh_RE和启动子Gb_expa2，其中所述红株突变体基因Gh_RE的序列如序列表SEQ ID NO.1所示，所述启动子Gb_expa2的序列如序列表SEQ ID NO.2所示。2.一种遗传工程菌，其特征在于，所述遗传工程菌包含权利要求1所述的表达载体。3.权利要求1所述的表达载体或权利要求2所述的遗传工程菌在制备转基因棕色棉花中的应用。4.一种权利要求1所述的表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括：以红株突变体的cDNA为模板，扩增得到SEQ ID NO.1所示的序列，并与包含有启动子Gb_expa2的载体连接，即得到所述表达载体。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，以红株突变体的cDNA为模板，以SEQ ID NO.3-4所述的序列为引物，扩增得到SEQ ID NO.1所示的序列。6.一种转基因棕色棉花的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的表达载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入棉花宿主细胞，诱导宿主细胞表达即得所述转基因棕色棉花。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1、按权利要求4或5所述的构建方法得到表达载体，并将表达载体导入到农杆菌中，并用农杆菌活化培养基悬浮得到农杆菌菌液；步骤2、选取棉花种子剥去种皮，灭菌后接种于无菌苗培养基中，得到无菌苗下胚轴；步骤3、将步骤2得到的无菌苗下胚轴切成小段后接种于步骤1的农杆菌菌液中进行侵染，接着转移到无菌滤纸上吸干残留菌液；步骤4、将步骤3得到的侵染...

【专利技术属性】
技术研发人员：林忠旭，张献龙，汪念，张贝贝，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：