一种MBP重组蛋白以及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种MBP重组蛋白以及其应用，通过抗原结构优化和细胞亚定位改造，提高了MBP重组蛋白在CBA试剂盒产品的稳定性，以及对MBP抗体检测的灵敏度和检测速率，特异性达到100％。100％。100％。

【技术实现步骤摘要】
一种MBP重组蛋白以及其应用


[0001]本申请涉及生物
，具体涉及一种MBP重组蛋白以及其应用。

技术介绍

[0002]多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)是人类中枢神经系统(CentralNervous System，CNS)的一种后天性脱髓鞘疾病。该疾病的遗传易感性或抗性被认为与位于第六条染色体短臂上的HLA-DR-DQ区域内或附近的基因有关。自身免疫机制在MS相关的脱髓鞘疾病过程中起重要作用，属于特异性抗原介导的细胞免疫和体液免疫共同参与的炎性脱髓鞘疾病。目前尚无证据说明何种抗原在MS的病因中最为重要，但有力证据表明髓鞘碱性蛋白 (Myelin Basic Protein，MBP)比较关键，MS患者由于免疫功能的异常，使 MBP具有自身抗原性，引起T淋巴细胞致敏活化和B细胞克隆扩增、表达效应功能，产生了MBP抗体(Myelin Basic Protein Antibody，MBPA)，这些抗体在T细胞参与下，作用于MBP和其它完整的髓鞘磷脂蛋白，故认为MBP 及MBPA在MS的发病机制中起关健作用。
[0003]MBP是构成髓鞘的主要成分之一，具有神经组织特异性。当神经组织受损时，游离MBP进入脑脊液(Cerebrospinal Fluid，CSF)或(和)血液，导致体液MBP含量增高并可能刺激机体产生MBPA自身抗体。国内外学者曾对急性脑外伤、脑血管疾病、多发性硬化、脑炎和脑膜炎等患者CSF和血清 MBP含量进行研究，一致认为CSF和血清MBP是在一定程度上反映了CNS 有无实质性损害，特别是有无髓鞘脱失的一个较为特异性的生化指标，对判断病情严重程度和预后有重要意义。
[0004]由于MS的可靠特征是增加了血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)IgG 的合成，因此以前的研究集中于针对髓磷脂蛋白的潜在人体自身免疫机制。 MBPA经常在患有急性视神经炎和活动性MS的患者的脑脊液(CSF)以及 MS患者的CNS组织中发现。人类MBP分子上的抗MBP表位范围已通过合成肽研究进行了估算。
[0005]由于MBP是一种封闭的自身抗原，当MBP暴露或释放至CSF中时，可引起免疫应答，并刺激机体产生MBPA自身抗体。已在MS患者血清和CSF 中发现针对MBP的特异抗体。这些抗体在T细胞参与下，作用于MBP和其它完整的髓鞘磷脂蛋白，导致多种神经系统疾病产生。故CSF或血清MBP 及其抗体含量测定可作为急性脑损害和急性脱髓鞘的特异生化指标，其含量的高低反映了损害的范围和严重程度。另外，由于MBP属机体隐蔽性抗原， MBP的释放入血可诱发自身免疫性炎症反应，进一步引起髓鞘的破坏。通过测定不同疾病的血清MBP水平，有助于了解疾病的进展，因此，在神经损伤时测定血清MBP水平具有重要价值。
[0006]目前血清MBP检测手段众多，诸如ELISA，膜条法等。不过由于血液样本成分复杂，有些成分与ELISA板产生非特异性结合，导致ELISA检测法的假阳性率较高；膜条法仅能检测识别线性区域的抗体，导致膜条法检出率偏低。因此，目前常用的检测手段，如免疫荧光、ELISA、免疫印迹、免疫组化等，都有检测过程耗时较长，步骤繁琐，抗体需求量大，成本高，灵敏度不高等缺点，利用这些方法很难一次性对大批量样本同时检测或针对某一个样本进行反复检测。
[0007]综上，目前市场上多发性硬化症检测试剂盒稀缺，而且常规检测方法局限性。因此，亟需一种经济、快速、易操作的检测试剂盒，为疑似脱髓鞘患者定制检测方案，以达到精准的用药和治疗需求。有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本申请提供一种MBP重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1 所示，或与该氨基酸序列有至少80％一致性的氨基酸序列。
[0009]另一方面，本专利技术提供了一种编码权利要求1所述MBP重组蛋白的基因。
[0010]在一些具体实施方案中，所述基因为核酸序列如SEQ ID No.2所示，或与该核酸序列有至少80％一致性的核酸序列。
[0011]另一方面，本专利技术还提供了一种含权利要求2或3所述基因的重组质粒。
[0012]在一些具体实施方案中，所述重组质粒采用mEGFP标记MBP重组蛋白的完整开放阅读框架。
[0013]另一方面，本专利技术还提供了一种上述重组质粒的细胞株或重组菌，优选的，细胞株为上述重组质粒转染AD293细胞所得。
[0014]另一方面，本专利技术还提供了一种检测MBP抗体的试剂盒，包括权利要求 4-5任一所述重组质粒，或权利要求6所述的细胞株或重组菌；更优选的，所述试剂盒还包括AD293细胞株、2％多聚甲醛、5％的羊血清白蛋白的PBS 溶液、标记的山羊抗人IgG。
[0015]另一方面，本专利技术还提供了一种MBP抗体检测试剂的制备方法，方法包括：对权利要求6所述的细胞株进行培养，以及固定、封闭、孵育和封片步骤。
[0016]在一些具体实施方案中，所述固定步骤为当细胞密度为70-80％时，采用 2-5％多聚甲醛20-30℃固定10min，优选地，细胞密度为75％时采用2％多聚甲醛25℃固定。
[0017]在一些具体实施方案中，所述封闭步骤为采用5％的羊血清白蛋白的PBS 溶液20-30℃封闭1h，优选地，采用5％的羊血清白蛋白的PBS溶液25℃封闭。
[0018]在一些具体实施方案中，所述孵育步骤包括一抗孵育、二抗孵育，其中一抗孵育为加入采用封闭液倍增稀释的待测血清(1:20)，3-5℃孵育14-20h，优选地，一抗孵育采用4℃孵育15h；二抗孵育为采用标记的山羊抗人IgG 避光20-30℃孵育50-60min，优选地，二抗孵育采用25℃孵育60min。
[0019]另一方面，本专利技术还提供了一种检测MBP抗体的方法，所述方法包括权利要求8-11任一所述方法，并进一步包括荧光检测步骤。
[0020]另一方面，本专利技术还提供了权利要求1所述蛋白、权利要求2-3任一所述基因、权利要求4-5任一所述重组质粒，或权利要求6所述的细胞株或重组菌在制备MBP抗体检测试剂中的应用。
[0021]本申请的具体试验方法如下：
[0022]1、构建重组质粒：根据设计的基因序列，合成嵌合基因，连接到载体 pcDNA3.1上，构建出用mEGFP标记MBP重组蛋白的完整开放阅读框架的真核表达载体，得到MBP重组蛋白并携带mEGFP的质粒；
[0023]2、质粒转染：将上述质粒转染培养好的AD293细胞，得到携带重组质粒的AD293细胞；
[0024]3、细胞培养：将经多聚赖氨酸处理96孔细胞培养板中，加入携带重组质粒的AD293细胞，并进行培养；
[0025]4、细胞固定：当携带重组质粒的AD293细胞的密度为70％～80％时，采用2％多聚甲醛固定液室温固定10min；
[0026]5、封闭：细胞固定完毕后，采用封闭液室温封闭1.0h；其中，封闭液是含质量分数为5％的羊血清白蛋白的PBS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MBP重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或与该氨基酸序列有至少80％一致性的氨基酸序列。2.一种编码权利要求1所述MBP重组蛋白的基因；优选的，所述基因核酸序列如SEQ ID No.2所示，或与该核酸序列有至少80％一致性的核酸序列。3.一种含权利要求2所述基因的重组质粒；优选的，所述重组质粒采用mEGFP标记MBP重组蛋白的完整开放阅读框架。4.一种含权利要求3所述重组质粒的细胞株或重组菌；优选的，所述细胞株为权利要求3所述重组质粒转染AD293细胞所得。5.一种检测MBP抗体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述重组质粒，或权利要求4所述的细胞株或重组菌；优选的，所述试剂盒还包括AD293细胞株、2％多聚甲醛、5％的羊血清白蛋白的PBS溶液、标记的山羊抗人IgG。6.一种MBP抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，包括对权利要求4所述的细胞株进行培养步骤，以及固定步骤、封闭步骤、孵育步骤和封片步骤。7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述固定步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洋，张超，王春霞，李诗濛，任用，
申请(专利权)人：江苏先声医疗器械有限公司江苏先声诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：