人抗AAV2衣壳多克隆抗体表位制造技术

本发明专利技术提供了人抗AAV衣壳多克隆抗体构象表位，包括中和抗体的表位。这些表位可通过人抗AAV2或其它AAV菌株衍生的衣壳多克隆抗体来识别。这些表位中的一个或多个表位可发生突变，以形成可逃逸抗体中和的AAV2衍生衣壳和其它AAV菌株衍生衣壳。本发明专利技术还提供了鉴定人抗AAV衣壳多克隆抗体构象表位的方法。AAV衣壳多克隆抗体构象表位的方法。AAV衣壳多克隆抗体构象表位的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人抗AAV2衣壳多克隆抗体表位
[0001]相关申请
[0002]本专利申请要求2018年5月4日提交的美国临时专利申请62/667360号的优先权，并且该文献据此全文以引用方式并入。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004]本专利技术得到了美国政府支持，由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)颁发了授权书NS088399。美国政府拥有本专利技术的某些权利。

技术介绍

[0005]病毒中和抗体(NtAb)表位作图可有助于用于预防和/或治疗感染性疾病的新疫苗和药物的开发。另外，病毒NtAb表位作图可有助于基因递送载体的开发。对病毒NtAb表位的鉴定与了解可协助病毒载体组分的可避开宿主免疫应答的基因工程，因为宿主免疫应答可能成为有效体内基因治疗的障碍。
[0006]腺相关病毒(AAV)是有望用于基因疗法的体内基因递送载体。然而，在将AAV用作体内基因递送载体方面仍有各种问题有待解决，包括需要针对有益临床结果的高载体剂量、有效限制针对病毒蛋白的宿主免疫应答、混杂的病毒嗜性、以及预先存在的抗AAV中和抗体在人体内的盛行率。
[0007]已从人类和非人类灵长类组织中分离出多种天然存在的血清型和亚型(Gao G等人，J Virol(《病毒学杂志》)，第78期，第6381-6388页，2004年和Gao G等人，Proc Natl Acad Sci USA(《美国科学院院报》)，第99期，第11854-11859页，2002年)。在新近鉴定出的AAV分离株中，AAV血清型8型(AAV8)和AAV血清型9型(AAV9)受到关注，因为衍生自这两种血清型的重组AAV载体可转导多种器官，包括肝脏、心脏、骨骼肌以及在经由外周全身施用后具有很高疗效的中枢神经系统(Foust KD等人，Nat Biotechnol(《自然
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生物技术》)，第27期，第59-65页，2009年；Gao等人，2004年，同上文；Ghosh A等人，Mol Ther(《分子治疗》)，第15期，第750-755页，2007年；Inagaki K等人，Mol Ther(《分子治疗》)，第14期，第45-53页，2006年；Nakai H等人，J Virol(《病毒学杂志》)，第79期，第214-224页，2005年；Pacak CA等人，Circ Res(《循环研究》)，第99期，e3-e9，2006年；Wang Z等人，Nat Biotechnol(《自然
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生物技术》)，第23期，第321-328页，2005年；以及Zhu T等人，Circulation(《循环》)，第112期，第2650-2659页，2005年)。
[0008]已经假定AAV8和AAV9载体的稳健转导性归因于这些细胞类型的强嗜性、载体的有效细胞摄取量和/或病毒体外壳在细胞中的快速脱壳(Thomas CE等人，J Virol(《病毒学杂志》)，第78期，第3110-3122页，2004年)。此外，性能更好的衣壳工程化AAV载体的出现大大拓宽了AAV载体作为载体工具包的效用(Asokan A等人，Mol Ther(《分子治疗》)，第20期，第699-708页，2012年)。AAV载体介导基因疗法的概念验证已在人类疾病的许多临床前动物模型中得到证实。已针对包括下列的遗传疾病展开或完成I/II期临床研究：B型血友病(Manno CS等人，Nat Med(《自然
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医学》)，第12期，第342-347页，2006年和Nathwani AC等人，N Engl J Med(《新英格兰医学杂志》)，第365期，第2357-2365页，2011年)；肌营养不良
(Mendell JR等人，N Engl J Med(《新英格兰医学杂志》)，第363期，第1429-1437页，2011年)；心力衰竭(Jessup M等人，Circulation(《循环》)，第124期，第304-313页，2011年)；致盲性视网膜病(Maguire AM等人，Lancet(《柳叶刀》)，第374期，第1597-1605页，2009年)；α1抗胰蛋白酶缺乏症(Flotte TR等人，Hum Gene Ther(《人类基因治疗》)，第22期，第1239-1247页，2011年)；以及脊肌萎缩症(Mendell JR等人，N Engl J Med(《新英格兰医学杂志》)，377期，第1713-1722页，2017年)等等。
[0009]虽然AAV载体已广泛用于临床前动物研究并且已在临床安全性研究中进行了测试，但目前AAV载体介导型基因递送系统对于更广泛的临床应用而言通常仍是次优的。AAV病毒衣壳蛋白的序列限定了特定AAV载体的许多特征。例如，衣壳蛋白影响特征，诸如衣壳结构和组装、与AAV非结构蛋白诸如Rep和AAP蛋白的相互作用、与宿主体液和细胞外基质的相互作用、血液中病毒的清除率、血管通透性、抗原性、对NtAb的反应性、组织/器官/细胞类型嗜性、细胞附着与内化效率、细胞内运输途径和病毒体脱壳速率。此外，给定AAV衣壳氨基酸序列与AAV载体特性之间的关系是不可预测的。
[0010]预先存在的抗AAV衣壳的NtAbs在人体中的高盛行率显著阻碍了AAV载体介导型基因疗法的成功。人们一直在关注开发可避开NtAb的“隐形”AAV载体；然而，此类AAV载体的形成通常依赖于关于NtAb表位的更全面信息，该信息目前仍然有限，因为尚无对动物和人血清中的多克隆抗AAV衣壳抗体进行简单有效地表位作图的方法。
[0011]DNA条形码AAV2R585E六肽(HP)扫描衣壳突变体库已经产生，其中AAV2衍生的HP被其它血清型衍生的那些替换。这些库已经静脉注射到小鼠携带的抗AAV1或AAV9衣壳抗体中，这导致鉴定出作为小鼠血清中抗AAV NtAb的表位的AAV1衣壳中的452-QSGSAQ-457(SEQ ID NO:1)和AAV9衣壳中的453-GSGQN-457(SEQ ID NO:2)(Adachi K等人，Nat Commun(《自然
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通讯》)，第5期，第3075页，2014年)。这些表位对应于衣壳上三重对称轴突起的最高峰。此外，通过相同的体内方法，此区域也可用作小鼠抗AAV7 NtAb的表位。被称为“AAV条形码序列(AAV Barcode-Seq)”基于测序的高通量方法可实现对数百种不同AAV菌株的表型的表征，并且可应用于抗AAV NtAb表位作图。
附图说明
[0012]结合附图，根据以下说明和所附权利要求，本文公开的实施方案将变得更完全显而易见。这些附图仅示出典型的实施例，其将通过使用附图以另外的特殊性和细节进行描述，在所述附图中：
[0013]图1A示出了经DNA条形编码的AAV基因组的图谱，该AAV基因组包含AAV2 pA下游的一对12个核苷酸长的DNA条形码(lt-VBC和rt-VBC)。每个病毒条形码(VBC)可单独进行PCR扩增。这类经DNA条形编码的AAV载体基因组曾本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种鉴定第一AAV菌株的AAV衣壳蛋白上的一个或多个表位的方法，所述方法包括以下步骤：制备多个AAV衣壳突变体，其中每个AAV衣壳突变体包括来自第二AAV菌株的改变的衣壳蛋白，所述改变的衣壳蛋白包括一个或多个改变的氨基酸，并且其中所述一个或多个改变的氨基酸被来自所述第一AAV菌株的所述AAV衣壳蛋白的对应氨基酸中的一个或多个氨基酸替换；使所述多个AAV衣壳突变体与多个抗体反应，其中每个抗体结合到所述第一AAV菌株的所述AAV衣壳蛋白上的一个或多个表位；收集结合到一个或多个抗体的所述AAV衣壳突变体；以及鉴定结合到一个或多个抗体的所述AAV衣壳突变体。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一AAV菌株为AAV2。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二AAV菌株为AAV9。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二AAV菌株为AAV5。5.根据权利要求1所述的方法，其中收集结合到一个或多个抗体的所述AAV衣壳突变体包括免疫沉淀结合到一个或多个抗体的所述AAV衣壳突变体。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中每个AAV衣壳突变体包括至少五个氨基酸，所述至少五个氨基酸被来自所述第一AAV菌株的所述AAV衣壳蛋白中的五个对应氨基酸替换。7.根据权利要求1或2所述的方法，其中每个AAV衣壳突变体包括至少六个氨基酸，所述至少六个氨基酸被来自所述第一AAV菌株的所述AAV衣壳蛋白中的六个对应氨基酸替换。8.根据权利要求1或2所述的方法，其中每个AAV衣壳突变体包括至少十二个氨基酸，所述至少十二个氨基酸被来自所述第一AAV菌株的所述AAV衣壳蛋白中的十二个对应氨基酸替换。9.一种包括至少一个改变的衣壳表位的AAV衣壳突变体蛋白，其中所述至少一个改变的衣壳表位包括至少一个改变的氨基酸。10.根据权利要求9所述的AAV衣壳突变体蛋白，其中所述突变型AAV衣壳蛋白被构造成逃逸抗体结合或中和。11.一种包括根据权利要求9或10所述的AAV衣壳突变体蛋白的AAV载体。12.一种包含根据权利要求11所述的AAV载体以及可药用的佐剂、赋形剂、载子或稳定剂的药物组合物。13.一种对根据权利要求9所述的突变型AAV衣壳蛋白进行编码的核酸序列。14.一种包括根据权利要求13所述的核酸序列的质粒。15.根据权利要求9所述的AAV衣壳突变体蛋白，其中所述至少一个改变的衣壳表位包括至少两个改变的氨基酸。16.根据权利要求9所述的AAV衣壳突变体蛋白，其中所述至少一个改变的衣壳表位包括至少三个改变的氨基酸。17.根据权利要求9所述的AAV衣壳突变体蛋白，其中所述至少一个改变的衣壳表位包括至少四个改变的氨基酸。18.根据权利要求9所述的AAV衣壳突变体蛋白，其中所述至少一个改变的衣壳表位包括至少五个改变的氨基酸。
19.根据权利要求9所述的AAV衣壳突变体蛋白，所述AAV衣壳突变体蛋白包括至少两个改变的衣壳表位，其中每个改变的衣壳表位包括至少一个改变的氨基酸。20.一种包括根据权利要求15至19中任一项所述的AAV衣壳突变体蛋白的AAV载体。21.一种包含根据权利要求20所述的AAV载体以及可药用的佐剂、赋形剂、载子或稳定剂的药物组合物。22.一种在表位的氨基酸序列中包括一次或多次突变的AAVx衍生衣壳，所述表位选自表位1、表位2、表位3、表位4、表位5、表位6、表位7、表位8、表位9或表位10中的至少一者。23.根据权利要求22所述的AAVx衍生衣壳，其中所述表位的所述氨基酸序列是随机的。24.根据权利要求22所述的AAVx衍生衣壳，其中所述表位的氨基酸序列中的所述一次或多次突变衍生自除AAVx之外的AAV菌株。25.根据权利要求22所述的AAVx衍生衣壳，其中AAVx为AAV2。26.根据权利要求25所述的AAV2衍生衣壳，其中所述抗体表位的氨基酸序列中的所述一次或多次突变是随机的。27.根据权利要求25所述的AAV2衍生衣壳，其中所述表位的氨基酸序列中的所述一次或多次突变衍生自除AAV2之外的AAV菌株。28.根据权利要求22所述的AAvx衍生衣壳，其中所述一次或多次突变处于氨基酸序列中，所述氨基酸序列处于选自以下中的至少一者的表位中：表位1：439-DQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASD-469(SEQ ID NO:5)；表位2：650-NTPVPANPSTTFSAAKFASFITQ-672(SEQ ID NO:6)；表位3：700-YTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGT-728(SEQ ID NO:7)；表位4：243-STRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNH-271(SEQ ID NO:9)；表位5：320-VKEVTQNDGTTTIANNLT-337(SEQ ID NO:10)；表位6：498-SEYSWTGATKYHLNGRDSL-516(...

【专利技术属性】
技术研发人员：琪，
申请(专利权)人：俄勒冈健康与科学大学，
类型：发明
国别省市：