一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法技术

本发明专利技术公开一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法，该方法通过GC/TOF

【技术实现步骤摘要】
一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法


[0001]本专利技术属于代谢组学
，涉及一种杨树高温胁迫的代谢组学分析方法，具体涉及一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法。

技术介绍

[0002]气候变化增加了全球极端高温出现的频率。高温胁迫是主要的环境胁迫之一，限制了植物的生长、代谢以及产量。植物作为固着生物，已经进化出复杂多样的系统响应高温，例如，植物利用抗氧化物酶清除由氧化胁迫所产生的过多活性氧(ROS)、通过积累一些渗透调剂物质(脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖等)减轻渗透胁迫伤害。有关树木对高温胁迫响应的研究主要集中在种群、个体、器官以及细胞的水平上，而分子水平上的研究较少。利用代谢组学研究可以直接测定高温胁迫下代谢物的变化情况。在拟南芥、番茄、玉米和小麦等植物中已经展开了高温胁迫代谢组方面的研究，并鉴定出一些响应热胁迫得到代谢产物。例如：一些可溶性糖(蔗糖、葡萄糖、甜菜苷、棉子糖)和一些有机酸(柠檬酸、富马酸、苹果酸、阿魏酸)。此外，毛白杨在我国分布较为广泛，因其树干高大通直，树叶青翠欲滴，树姿优美、俊秀挺拔，常用于城乡行道树和庭荫树，是重要的绿化和观赏树种。特别是毛白杨适应性强，在夏季城市热岛效应下依然能够正常生长，显示其有很强的抗高温。因此，了解杨树的抗高温机理具有现实意义和应用价值。
[0003]我们在期间研究中，对杨树设计温度处理：对照组和高温组。通过GC-MS测定了高温与对照叶片中的差异代谢物。本专利技术目的是筛选杨树响应高温的小分子代谢物，探明杨树高温胁迫下的代谢变化规律，阐释杨树对高温胁迫响应的代谢组学水平上的调控机制，为树木高温胁迫研究提供重要的参考依据，也为木本观赏植物抗高温研究提供有价值的参考。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于提供一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法，通过该方法可以探明杨树响应高温的代谢相关变化规律，为阐明植物高温胁迫代谢物通路的变化情况提供有力的分析方法。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法，该方法包括以下步骤：
[0007](1)样品制备：在不同温度条件下处理杨树，获得高温组和对照组杨树叶片样本，对所述的高温组和对照组杨树叶片样本进行代谢物制备分别获得高温组和对照组代谢物；
[0008](2)基于GC/TOF-MS对高温组和对照组代谢物进行检测：将步骤(1)获得的高温组和对照组代谢物分别经过衍生化处理后进行GC/TOF-MS检测分析获得高温组和对照组代谢物检测数据；
[0009](3)数据分析：对获得的高温组和对照组代谢物检测数据依次进行预处理分析、主成分及相关性分析、正交偏最小二乘法判别分析和组间差异分析获得高温组和对照组两组
之间的差异代谢物即为响应杨树高温胁迫的关键代谢物，并进行代谢通路分析。
[0010]作为一种优选技术方案，步骤(1)中处理所述高温组和对照组杨树的温度条件分别为：对照组(control,CTRL组)：25℃处理6小时；高温组(heat,H组)：先梯度升温，半小时内25℃升至35℃时，停留2小时后，再从35℃升至45℃，并维持45℃处理5小时；取顶芽下第3至第4个叶片，采样时间点：45℃5h。
[0011]作为一种优选技术方案，步骤(1)中代谢物制备的过程为：取叶片组织样品加入EP管中，再加入提取溶剂和核糖醇溶液，所述的提取溶剂为按体积比计甲醇∶H2O＝3∶1的溶剂，所述核糖醇溶液的浓度为2mg/ml；用研磨仪处理萃取物4分钟后冰水浴5分钟，重复2次，冷冻离心15分钟(4℃,13000rpm)；取上清液转入GC/MS玻璃烧瓶中，在真空浓缩器中干燥提取物得到代谢物。
[0012]作为一种优选技术方案，步骤(2)中对获得的高温组和对照组代谢物进行衍生化处理的过程为：向干燥后的代谢物中加入甲氧胺盐试剂，待缓慢混匀后，80℃孵育30分钟；随后，迅速加入BSTFA，70℃孵育1.5h。
[0013]作为一种优选技术方案，步骤(2)中采用配置DB-5MS毛细管柱(5％二苯基，95％二甲基聚硅氧烷)的Agilent 7890气相色谱-飞行时间联用仪进行GC/TOF-MS检测分析，GC/TOF-MS具体分析条件为：进样量：1μL，不分流模式；载气：氦气；前进样口吹扫流速：3mL
·
min-1
；柱流速：1mL
·
min-1
；柱温：50℃保持1分钟，以10℃每分钟的速率上升至310℃，保持8分钟；前进样口温度：280℃；传输线温度：270℃；离子源温度：220℃；电离电压：-70eV；扫描方式：50-500m/z；扫描速率：20spectra/sec；溶剂延迟：460s，采集模式为全扫描模式。
[0014]作为一种优选技术方案，步骤(3)中对获得的高温组和对照组代谢物检测数据进行预处理分析是对数据进行过滤用于去除噪音数据获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据。
[0015]最优选的，采用Agilent ChemStation工作站采集总离子流图(TIC)进行可视化检查，通过多个样本图谱的重叠，判断仪器在分析样本时是否符合代谢组学分析要求，进行稳定性和重复性的考察。同时，为了能够对下游数据进行更好的分析，对数据进行过滤，目的是去除噪音数据获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据。所用方法为：四分位数极差或四分位间距(interquartile range)、保留单组空值小于等于50％或所有组中空值小于等于50％的峰面积数据。对原始数据中的缺失值进行模拟，数值模拟方法为最小值二分之一法进行填补。对填补完以后的数据进行标准化处理，方法是内标归一法。
[0016]步骤(3)中所述的主成分及相关性分析为：对所有样本预处理后的数据进行主成分分析，初步了解各组样本之间的总体差异和组内的变异度大小。
[0017]步骤(3)中所述的正交偏最小二乘法判别分析的过程为：使用SIMCA软件(V14.1,MKS Data Analytics Solutions,Umea,Sweden)对多维统计模型进行正交矫正偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，最大化地凸显模型内部与预测主成分(Predictive component)相关的差异；OPLS-DA首先进行LOG转换+UV格式化处理的数据标度换算方式，接着对第一，二主成分进行建模分析；模型的质量用7折交叉验证进行检验，并用交叉验证后得到的R2Y(代表Y变量的可解释性)和Q2(代表模型的可预测性)对模型有效性进行评判；然后通过排列实验随机多次(n＝200)改变分类变量y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值对模型有效性做进一步的检验；R2Y(代表Y变量的可解释性)，Q2(代表模型的可预测性)越接近1说明OPLS-DA
模型越能很好地解释两组样本之间的差异。
[0018]这一过程需先建立多维统计模型，具体方法为：采用Agilent ChemStation工作站采集总离子流图(TIC)，取原始数据信号本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)样品制备：在不同温度条件下处理杨树，获得高温组和对照组杨树叶片样本，对所述的高温组和对照组杨树叶片样本进行代谢物制备分别获得高温组和对照组代谢物；(2)基于GC/TOF-MS对高温组和对照组代谢物进行检测：将步骤(1)获得的高温组和对照组代谢物分别经过衍生化处理后进行GC/TOF-MS检测分析获得高温组和对照组代谢物检测数据；(3)数据分析：对获得的高温组和对照组代谢物检测数据依次进行预处理分析、主成分及相关性分析、正交偏最小二乘法判别分析和组间差异分析获得高温组和对照组两组之间的差异代谢物即为响应杨树高温胁迫的关键代谢物，并进行代谢通路分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中处理所述高温组和对照组杨树的温度条件分别为：对照组：25℃处理6小时；高温组：先梯度升温，半小时内25℃升至35℃时，停留2小时后，再从35℃升至45℃，并维持45℃处理5小时；取顶芽下第3至第4个叶片，采样时间点：45℃5h。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中代谢物制备的过程为：取叶片组织样品加入EP管中，再加入提取溶剂和核糖醇溶液，所述的提取溶剂为按体积比计甲醇∶H2O＝3∶1的溶剂，所述核糖醇溶液的浓度为2mg/ml；用研磨仪处理萃取物4分钟后冰水浴5分钟，重复2次，冷冻离心15分钟；取上清液转入GC/MS玻璃烧瓶中，在真空浓缩器中干燥提取物得到代谢物。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中对获得的高温组和对照组代谢物进行衍生化处理的过程为：向干燥后的代谢物中加入甲氧胺盐试剂，待缓慢混匀后，80℃孵育30分钟；随后，迅速加入BSTFA，70℃孵育1.5h。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中采用配置DB-5MS毛细管柱的Agilent 7890气相色谱-飞行时间联用仪进行GC/TOF-MS检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕年军，金飚，任世雄，沈楠，冯婧娴，崔佳雯，陆维超，袁国振，蓝令，王艺，陈子琳，吴慧君，吴垠，何岭，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：