阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种阿魏菇Pleurotus ferulae lenzi中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法与应用，本发明专利技术的抗肿瘤蛋白提取物是将阿魏菇Pleurotus ferulae lenzi子实体烘干并研磨成粉后，经浸提、盐析、透析、冻干、离子交换而获得。该蛋白提取物命名为XD1，是分子量约为17.5kDa的单体蛋白；对人非小细胞肺腺癌细胞株A549的生长具有明显的抑制作用。本发明专利技术的阿魏菇Pleurotus ferulae lenzi抗肿瘤蛋白提取物为天然活性产物，对人类无毒副作用且对环境无污染；制备流程简单，易得，成本较低，适于工业化生产。业化生产。业化生产。

【技术实现步骤摘要】
阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法。

技术介绍

[0002]近年来，肿瘤作为最难治愈的疾病之一，已经严重影响到人类健康和生活质量，其发病率呈逐年上升的趋势。应用于临床治疗的方法经历了长久的探索，传统的手术切除法、放射化疗法、化学药物疗法等具有局限性、选择性差、易复发、易转移等缺点，难以彻底清除肿瘤细胞，因此，开发研制预防肿瘤的药物迫在眉睫。与人工合成的化学药物相比，天然抗肿瘤药物具有毒性低和安全性高的优势，大型食药用真菌因其独特的药理活性，成为抗肿瘤药物的重要来源。发挥抗肿瘤作用的物质主要包含多糖、蛋白质等大分子以及小分子物质，其中最重要的生物大分子蛋白质在医药和食品领域的应用上也具有广阔的前景。
[0003]阿魏菇(Pleurotusferulaelenzi)又被称作阿魏侧耳、阿魏蘑，在分类学上隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是新疆特色的食用菌，由于腐生或寄生在药用植物阿魏根茎部而有阿魏菇的名称。阿魏菇中富有钾、钙、硒、铁、镁、锗和铬等元素，且蛋白质含量约占干菇的20％，含有18种氨基酸，具备人体必需的8种氨基酸。阿魏菇同时具有较高的药用价值，可以防癌、抗癌并且能够养护肠胃、治疗肠道寄生虫等，故其也是新疆重要的中药材，具有良好的开发利用前景。
[0004]阿魏菇作为新疆的一种特有真菌，因其地理位置偏僻和人工栽培技术尚未完全成熟，受到的关注较少，因此对于阿魏菇的研究有待加深。近年来，对于阿魏菇生物活性成分的研究主要集中在多糖和粗提物方面，诸如多糖的分离纯化、结构分析及其抗氧化作用和免疫调节活性以及粗提物的抗肿瘤活性等。
[0005]1、杜彤等从阿魏菇中提取的多糖对于老龄鼠和果蝇的抗衰老有一定的效果；能够降低急性肝损伤小鼠血清中天冬氨酸转氨酶AST和丙氨酸转氨酶ALT含量，增强肝组织GSH和SOD活力，降低肝组织MDA水平，显著改善肝组织结构，减少肝细胞坏死。巩平等发现阿魏菇多糖能够联合顺铂通过诱导宫颈癌细胞凋亡，并且促进荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，提高免疫活性。陈庆庆等的研究中表明阿魏菇多糖对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、ABTS自由基有较强的清除效果。
[0006]2、王为兰证实阿魏菇子实体醇提取物对B16F10细胞、MCF-7细胞、Eca109细胞、HeLa细胞的生长有一定的抑制作用。张月明等从细胞凋亡角度探讨不同剂量水提物和醇提物对体外培养的四种肿瘤细胞人肝癌细胞株(QCY-7703,Q3)、人胃癌细胞株(MGC-803)、人宫颈癌细胞株(Hela)、小鼠肺腺瘤细胞株(SPC-A-1)生长抑制的作用，发现通过调节P53基因和FAS基因的转录和表达发挥抗肿瘤作用。Jo,Kyung-Jin等发现阿魏菇水提物可以降低喂食高脂饮食小鼠的脂质吸收，从而起到抗肥胖和抗糖尿病的作用。总的来说，目前对阿魏菇生物活性物质的研究大多集中在多糖，而蛋白方面较少，郑杰
[20]等提取了阿魏菇中的多酚氧化酶(PPO)，并对其理化性质做了简要测定，以及从杨爱霞阿魏菇中分离得到的大小为
17.5KD左右凝集素蛋白，能显著促进小鼠淋巴细胞的增殖，增强其免疫活性，尚未见从阿魏菇中提取抗肿瘤蛋白的相关报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的在于提供一种阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法，抑制人非小细胞肺腺癌细胞株A549的生长，弥补化学合成药物毒副作用高和安全性低的不足。
[0008]本专利技术所述阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物，来源于阿魏菇，是子实体烘干研磨成粉后，经浸提、盐析、透析、冻干、离子交换而获得的分子量为17.5kDa的单体蛋白。
[0009]所述阿魏菇Pleurotusferulaelenzi中抗肿瘤蛋白提取物是按照如下方法制备的：
[0010]1)将阿魏菇子实体50～70℃烘干并研磨成粉，溶解于蒸馏水溶液中，18～23℃浸提8～16小时，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液；
[0011]2)向上清液中加入(NH4)2SO4至饱和度为80％，2～6℃放置8～16小时，8000～12000rpm离心15～25min，收集沉淀，即得阿魏菇蛋白粗提物；
[0012]3)将阿魏菇蛋白粗提物用蒸馏水溶解，然后在2～6℃、5～10倍重量的蒸馏水中透析24～72小时，每间隔4小时更换一次蒸馏水，透析后10000～14000rpm离心15～25min收集上清液并进行冷冻干燥，即得阿魏菇蛋白粗粉；
[0013]4)将阿魏菇蛋白粗粉溶解于10～50mM、pH6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液中，上样于HiTrapQHP强阴离子交换柱，用含1mol/LNaCl的10～50mM、pH6.0～8.0Tris-HCl缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰；
[0014]5)将洗脱峰组分冷冻干燥后溶于10～50mM、pH6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液中，上样于DEAE-52弱阴离子交换柱，用含0.03mol/LNaCl的10～50mM、pH6.0～8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集该浓度下的洗脱峰，获得阿魏菇抗肿瘤蛋白提取物。
[0015]进一步的，步骤1)中阿魏菇子实体粉末与蒸馏水的料液比为1:10。
[0016]本专利技术采用SDS-PAGE进行纯度检测，证明阿魏菇Pleurotusferulaelenzi中抗肿瘤蛋白提取物是分子量为17.5kDa的单体蛋白。
[0017]本专利技术中阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物对人非小细胞肺腺癌细胞株A549的生长具有明显的抑制作用(可用于相应药物的制作中)，AnnexinV-FITC/PI双染色证明该蛋白提取物能够诱导肿瘤细胞凋亡。
[0018]本专利技术的优点和有益效果：
[0019](1)本专利技术中阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物为天然提取物，具有良好的安全性；(2)本专利技术中阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物为单一蛋白，为获得该蛋白的氨基酸序列及其编码基因提供了基础；(3)本专利技术中阿魏菇Pleurotus ferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物具有良好的抗肿瘤效果；(4)本专利技术中阿魏菇Pleurotus ferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物制备简单，成本低，适于大规模生产。
附图说明
[0020]图1本专利技术Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物的强离子交换层析图。
[0021]图2本专利技术Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物的弱离子交换层析图。
[0022]图3本专利技术Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物的SDS-PAGE图。
[0023]图4本专利技术Pleurotusferula本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物，其特征在于所述的抗肿瘤蛋白提取物来源于阿魏菇，是子实体烘干研磨成粉后，经浸提、盐析、透析、冻干、离子交换而获得的分子量为17.5kDa的单体蛋白。2.权利要求1所述的阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将阿魏菇子实体50～70℃烘干去除水分后研磨成粉末，溶解于蒸馏水溶液中，18～23℃浸提8～16小时，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液；2)向上清液中加入(NH4)2SO4至饱和度为80％，2～6℃放置8～16小时，8000～12000rpm离心15～25min，收集沉淀，即得阿魏菇蛋白粗提物；3)将阿魏菇蛋白粗提物用蒸馏水溶解，然后在2～6℃、5～10倍重量的蒸馏水中透析24～72小时，每间隔4小时更换一次蒸馏水，透析后10000～14000rpm离心15～25min收集上清液并进行冷冻干燥，即得阿魏菇蛋白粗粉；4)将阿魏菇蛋白粗粉溶解于10～50mM、pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液中，上样于HiTrap Q HP强阴离子交换柱，用含1mol/LNaCl的10～50mM、pH 6.0～8.0Tris-HCl缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰；5)将洗脱峰组分冷冻干燥后溶于10～50mM、pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液中，上样于DEAE-52弱阴离子交换柱，用含0.03mol/LNaCl的10～50mM、pH 6.0～8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集该浓度下的洗脱峰，获得阿魏菇抗肿瘤蛋白提取物。3.根据权利要求2所述的阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘方，刘梦函，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：