一种可用于临床样品等位基因分型的DNA纳米筛可再生电化学传感器制造技术

本发明专利技术公开一种可用于临床样品等位基因分型的DNA纳米筛可再生电化学传感器，特点是通过巯基修饰DNA在金电极表面的自组装构建一种能够区分ssDNA和dsDNA的界面型DNA纳米筛，其空腔大小可以通过改变巯基修饰DNA的浓度来调节，通过以[Ru(NH3)6]

【技术实现步骤摘要】
一种可用于临床样品等位基因分型的DNA纳米筛可再生电化学传感器


[0001]本专利技术涉及可用于临床样品等位基因分型的DNA纳米筛可再生电化学传感器的制备方法，属于生物传感


技术介绍

[0002]单核苷酸多态性（SNPs），也称点突变，是癌症诊断和预后有价值的遗传标志，也是预测药物疗效及耐药性的重要指标之一。目前，大多数应用于SNPs的检测方法是基于PCR扩增技术和直接测序法，但这些方法成本高、需要精密的仪器设备且对人工操作高要求，以及在检测低丰度点突变方面能力有待提高，因此，不适合作为临床常规性的诊断工具。DNA电化学传感器由于具有灵敏度高、成本低、信号读出方式简便以及易于微型化等优点，在SNP检测以及开发成床边检测工具方面具有其独特的优势。
[0003]随着工具酶、纳米材料及分子器件的引入，DNA电化学传感器的灵敏度和特异性不断提升，然而它的稳定性和重现性一直困扰着广大科研工作者。传感器在组装过程中不可避免会产生批间差异，即传感器间的差异（chip-to-chip variance），主要包括基底差异以及界面功能化修饰差异，是导致传感器重现性差的主要原因之一
[1]。而通过构建可再生传感器，实现单一传感器对多个样品的连续检测，可有效地消除传感器间的差异，不仅进一步降低成本，且提高了传感器的重现性、可靠性以及准确性
[2]。
[0004]为实现DNA电化学传感器的再生，已报道方法的切入点主要是考虑如何破坏DNA双链间的氢键，如通常采用改变pH值、提高温度和添加化学试剂（胍盐、尿素或甘氨酸等）
[3-7]等方法。然而，这些方法不仅会改变界面离子的种类和排布，还会不可逆地破坏界面上DNA捕获探针的二级结构，使DNA自组装单分子层的电荷和构象发生改变，难以获得持续且可靠的再生效果
[2]。因此，迫切需要从另一个角度来开发具有高稳定性和可靠性的可再生DNA电化学传感器。
[0005]通常，用于DNA检测的DNA电化学传感器的制备包括在电极表面上形成DNA 自组装单分子层（SAM），通过靶标诱导的三明治结构与标记探针进行非共价杂交，以及使用电化学技术监控电子转移过程。在“信号开”的检测模式下，通常需要采用“倒立型杂交三明治”使如亚甲基蓝（MB）和二茂铁（Fc）等电活性物质靠近电极表面。值得注意的是，这种倒立型杂交过程与通常在酶催化的DNA电化学传感器
[8]中使用的“正立型杂交模式”完全不同。对于后者，仅需要参与杂交的单链DNA（ssDNA）部分进入SAM即可完成杂交，但是，前者需要整个双链DNA（dsDNA）部分渗透进入SAM，使得突出的ssDNA与捕获探针充分碰撞才能形成三明治结构。据我们所知，ssDNA像羊毛球一样盘绕，而dsDNA具有像棍棒一样的刚性结构特征，因此，这种明显的柔韧性差异应使它们对SAM具有不同的渗透性。
[0006]基于以上讨论，本专利技术公开一种新型的可再生DNA电化学传感器，通过调节巯基修饰DNA浓度来对SAM的探针间距进行纳米调控，形成能够区分ssDNA和dsDNA的DNA纳米筛。我们假设，棒状dsDNA由于其长度大于纳米筛的腔长，会被阻挡在纳米筛之外，不能以倒置的
2020, 92(6):4498-4503.[9] Johnson-Buck, A.; Su, X.; Giraldez, M. D.; Zhao, M.; Tewari, M.; Walter, N. G. Kinetic fingerprinting to identify and count single nucleic acids. Nat. Biotechnol. 2015, 33 (7), 730-732。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种可用于临床样品等位基因分型的DNA纳米筛可再生电化学传感器及其对CYP2C19等位基因分型的电化学传感方法。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面用于对CYP2C19等位基因分型的电化学传感方法，其特征是通过巯基修饰DNA（Capture Probe）在金电极表面的自组装构建一种能够区分ssDNA和dsDNA的界面型DNA纳米筛，其空腔大小能通过改变巯基修饰DNA的浓度来调节，通过以[Ru(NH3)6]3+
为氧化还原的电化学计时库仑法对界面上巯基修饰DNA的间距进行表征，当巯基修饰DNA的间距小于dsDNA的长度时，dsDNA由于其刚性结构不能透过DNA纳米筛，而无规则卷曲结构的ssDNA由于其高度的柔韧性能进入纳米筛，接着以连接酶循环反应为ssDNA扩增策略对样品中的等位基因进行扩增，用所构建的DNA纳米筛传感界面对ssDNA进行检测，使用方波伏安法对电信号进行采集，根据电流大小实现对目标链的定性定量分析；在检测完成后，加入再生探针破坏ssDNA的动态杂交过程，形成的dsDNA由于其刚性结构且长度大于巯基修饰DNA的间距而无法杂交，从而使信号物质从电极表面脱落，电极能再生并用于下一次检测，单个传感器能对7个不同样品进行连续检测。
[0010]所述的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面的制备方法，包括如下步骤：（1）金电极用0.05 μm Al2O3和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗；将超声好的电极置于0.5 M H2SO4中循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，N2吹干后待用；（2）将巯基修饰DNA分别稀释至以下浓度： 2 μM、1 μM、800 nM、600 nM、500 nM、400 nM、200 nM；取3 μl上述各浓度的巯基修饰DNA溶液分别滴至经预处理的裸金电极表面，室温放置过夜后，以PBS洗液冲洗电极表面，氮气吹干后将电极置于100 μl的2 mM MCH溶液中浸泡2 h，用双蒸水清洗，氮气吹干备用；（3）将步骤（2）获得的电极浸入PH=7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl中进行第一次计时电量法测量，电压0 V至-0.5 V，500 ms，记录截距值Q1；测量完成后将电极浸入50 μM氯化六胺合钌溶液中，室温孵育10 min，之后将电极用双蒸水彻底冲洗后再次浸入PH=7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl中进行第二次计时电量法测量，电压0 V至-0.5 V，500 ms，记录截距值Q2，并计算两次测量得到的截距值的差值：ΔQ=Q2-Q1；（4）将步骤（3）得到的ΔQ代入以下公式：,其中Γ0表示限定在电极表面附近的氯化六胺合钌的量，n是每个氧化还原过程转移的电子数，n=1，F是法拉第常数：F=96485.33289
±
0.00059 C/mol，A是电极面积；将计算得到的Γ0代入公式：
，其中Γ
DNA
表示界面巯基修饰DNA的密度，z是氧化还原分子所带的电荷量：z=3，m是巯基修饰DNA的碱基个数：m=63，N
A
是阿伏伽德罗常数：N
A
≈6.02
×
10
23...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面用于对CYP2C19等位基因分型的电化学传感方法，其特征是通过巯基修饰DNA（Capture Probe）在金电极表面的自组装构建一种能够区分ssDNA和dsDNA的界面型DNA纳米筛，其空腔大小能通过改变巯基修饰DNA的浓度来调节，通过以[Ru(NH3)6]
3+
为氧化还原的电化学计时库仑法对界面上巯基修饰DNA的间距进行表征，当巯基修饰DNA的间距小于dsDNA的长度时，dsDNA由于其刚性结构不能透过DNA纳米筛，而无规则卷曲结构的ssDNA由于其高度的柔韧性能进入纳米筛，接着以连接酶循环反应为ssDNA扩增策略对样品中的等位基因进行扩增，用所构建的DNA纳米筛传感界面对ssDNA进行检测，使用方波伏安法对电信号进行采集，根据电流大小实现对目标链的定性定量分析；在检测完成后，加入再生探针破坏ssDNA的动态杂交过程，形成的dsDNA由于其刚性结构且长度大于巯基修饰DNA的间距而无法杂交，从而使信号物质从电极表面脱落，电极能再生并用于下一次检测，单个传感器能对7个不同样品进行连续检测。2.权利要求1所述的基于界面探针密度调控的可再生DNA纳米筛界面的制备方法，包括如下步骤：金电极用0.05 μm Al2O3和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗；将超声好的电极置于0.5 M H2SO4中循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，N2吹干后待用；将巯基修饰DNA分别稀释至以下浓度： 2 μM、1 μM、800 nM、600 nM、500 nM、400 nM、200 nM；取3 μl上述各浓度的巯基修饰DNA溶液分别滴至经预处理的裸金电极表面，室温放置过夜后，以PBS洗液冲洗电极表面，氮气吹干后将电极置于100 μl的2 mM MCH溶液中浸泡2 h，用双蒸水清洗，氮气吹干备用；（3）将步骤（2）获得的电极浸入PH=7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl中进行第一次计时电量法测量，电压0 V至-0.5 V，500 m...

【专利技术属性】
技术研发人员：许雄伟，陈锦元，杨良永，翁秀华，林新华，刘周杰，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：