检测人SEPT9基因甲基化的试剂盒及其使用方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种检测人SEPT9基因甲基化的试剂盒及其使用方法、应用。该试剂盒包括检测或测量受试样品DNA中SEPT9基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针。本发明专利技术试剂盒能够显著提高早期肝癌的阳性检出率和特异性(真实阴性率)，可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子，检测灵敏度的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及改进血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。

【技术实现步骤摘要】
检测人SEPT9基因甲基化的试剂盒及其使用方法、应用


[0001]本专利技术属于生物技术和DNA检测
，尤其涉及一种用于肝癌检测的DNA甲基化 qPCR试剂盒及其使用方法，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个或多个目标基因靶点(例如SEPT9)的甲基化状态来用于肝癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]原发性肝癌以肝细胞癌为主。在全球范围内，肝癌是癌症相关死亡的第四大原因，在患者发病率方面排名第六位。其发病隐匿,无特异性临床表现,往往发现时已进展到晚期,错过了最好的治疗时机,因此预后较差。肝癌发现越早，治愈的可能性越大，但是早期肝癌一般无症状，无体征，不易被发现。临床上对于肝癌高危人群的诊断和随访主要依赖影像学和肿瘤标记物AFP的检测。然而，影像学(B超、CT、MRI等)和CEA，AFP等血清标记物的检测在早期肝癌的诊断上存在一定的局限性，前者设备成本高，操作技术要求强并且检测成本高；后者由于其灵敏度和特异度较低，仍然无法充分满足临床检测需要。此外，作为肝癌诊断金标准的组织活检的侵入性强，不适于早癌的筛查。并且这样的创伤性检测方式，给患者带来了非常大的生理病痛，因此患者不易接受。因此，在肝癌的早期诊断方面急需更精确更个性化的手段。
[0003]液体活检是用检测分子生物标志物来替代传统组织活检的非侵入性方法，其用于分析的生物样品(如DNA)可以从血液、尿液、唾液、痰液或组织样本中获得。与传统的癌症诊断方法相比，液体活检具有以下优势：
[0004]1.易取得，液体活检样本可从尿液、唾液和胸腔积液中获得；
[0005]2.比传统的肿瘤活组织检查更少侵入性；
[0006]3.能取样所有可能的癌细胞，而非仅局限于肿瘤活检的某部分；
[0007]4.便于早期发现癌症；
[0008]5.能用于监测肿瘤动态(治疗前、治疗间和治疗后)；
[0009]6.具有能作为理想识别标靶治疗因子的潜力。
[0010]坏死或凋亡的细胞释放到血液中的DNA，被称为循环游离DNA(circulating free DNA， cfDNA)，然而在肿瘤患者的血液中，一部分cfDNA来自死亡的肿瘤细胞，这部分DNA就被定义为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在，这些ctDNA 多为大约134-144bp的DNA片段，并携带一定的肿瘤特征(包括异常甲基化、突变、缺少、插入、拷贝数等)。较早期的癌症(意味着肿瘤尺寸较小且癌细胞较少)，释放较少的游离循环肿瘤ctDNA，而其浓度更小于游离cfDNA；当肿瘤负荷增加时，患者的ctDNA水平会升高。迄今为止，ctDNA是获得癌症患者血液中分子肿瘤相关改变的诊断、预后、以及预测信息的最佳材料。
[0011]DNA甲基化改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，且具有组织特异性，肿瘤
抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌前病变组织转化为恶性肿瘤细胞的重要分子机制。其中，SEPT9基因，即人类Septin9基因，位于染色体17q25的AC068594内，为S印tin基因家族的成员，与膜泡运输到胞质分裂的多种细胞功能相关。研究表明肝硬化患者ctDNA中SEPT9基因启动子区域甲基化与否，诊断患者是否已从肝硬化发展为肝癌，SEPT9 可以作为一个有效的表观遗传学的标志物，作为肝细胞癌的个性化诊断标签。因此，对SEPT9 基因的甲基化状态进行分析可用于诊断肝癌的状态。
[0012]循环肿瘤DNA(ctDNA)的甲基化分析可以为癌症诊断提供了一个可行的选择，但临床上使用ctDNA辅助癌症诊断和疗法选择的主要挑战，仍在于如何开发高灵敏度的检测方法以便在高cfDNA背景水平中区分微弱的ctDNA信号，特别是对于ctDNA浓度可能至pg/mL程度的早期诊断，对检测方法的灵敏度和选择性要求更高。然而，目前的检测试剂盒由于受到 DNA提取方法不佳、亚硫酸氢盐处理量差、用于检测甲基化DNA的引物或者探针设计不佳等定量PCR方法的限制，并不能很好地利用ctDNA甲基化基因进行肝癌的早期筛查和辅助诊断。因此，迫切需要更敏感和准确地检测DNA甲基化水平或状态的方法，以帮助肝癌诊断测定。

技术实现思路

[0013]本专利技术的目的在于提供一种用于肝癌早期诊断、检测或者筛查的血液单基因检测引物探针组合试剂盒，以解决现有技术中存在的检测方法特异性和敏感性过低的缺陷。
[0014]本专利技术的第一方面在于提供检测人SEPT9基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括检测或测量受试样品DNA中SEPT9基因甲基化状态或水平的特异性引物和探针。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，还包括括检测或测量受试样品DNA中ACTB基因甲基化状态或水平的特异性引物和探针。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，包括用于检测SEPT9基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:1-2和探针SEQ IDNO:3、特异性引物SEQ ID NO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQ ID NO:7-8和探针 SEQ ID NO:9。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，包括用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQ IDNO:10-11和探针SEQ ID NO:12。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11 均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述SEPT9基因探针SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5
’
端标记ABY，3
’
端标记QSY。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述ACTB基因探针SEQ ID NO:12核苷酸序列5
’
端标记 VIC，3
’
端标记MGBNFQ。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11 和所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12的长度为10-50nt。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒中还包含下述组成部分：dNTP混合溶液、
MgCl2溶液、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、PCR去离子水。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离DNA提取试剂和血浆游离DNA甲基化转化试剂。
[0025]在本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测人SEPT9基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括检测或测量受试样品DNA中SEPT9基因甲基化状态或水平的特异性引物和探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括括检测或测量受试样品DNA中ACTB基因甲基化状态或水平的特异性引物和探针。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，包括用于检测SEPT9基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:1-2和探针SEQ ID NO:3、特异性引物SEQ ID NO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQ ID NO:7-8和探针SEQ ID NO:9；和/或，包括用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQ ID NO:10-11和探针SEQ ID NO:12。4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交；和/或，所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述SEPT9基因探针SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5
’
端标记Cy5，3
’
端标记QSY；和/或，所述ACTB基因探针SEQ ID NO:12核苷酸序列5
’
端标记VIC，3
’
端标记MGBNFQ。6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11和所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12的长度为10-50nt。7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含下述组成部分：dNTP混合溶液、MgCl2溶液、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、PCR去离子水；和/或，所述试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离DNA提取试剂和血浆游离DNA甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志强，万季，蔡雪儿，罗海燕，王一杏，夏迪，汪健，金泰庆，关建洪，王弈，宋麒，
申请(专利权)人：深圳市新合生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：