一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的表达和纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种猴头菌来源的UDP

【技术实现步骤摘要】
一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的表达和纯化方法


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程
，具体涉及一种猴头菌321菌株来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的扩增用引物、表达载体、转化子及表达纯化方法。

技术介绍

[0002]UDP-葡萄糖-4差向异构酶(UDP-glucose-4-epimerase，GalE)是一种葡萄糖差向异构酶，在催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖之间的转换中起着关键作用。为了实现猴头菌321菌株来源的UDP-葡萄糖-4差向异构酶的表达，现有技术通常使用T4连接酶构建重组载体，但是步骤较繁琐，容易增加实验误差；此外，目前只能通过实验来验证UDP-葡萄糖-4差向异构酶在不同菌种内的底物亲和力，相对增加了研究的不确定性，现有技术缺乏一种在细菌中高效表达UDP-葡萄糖-4差向异构酶及纯化方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种UDP-葡萄糖-4-差向异构酶扩增用引物、表达载体、转化子及表达纯化方法。本专利技术能够制备得到大量高纯度且具备生物活性的目的蛋白。
[0004]本专利技术提供了一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的扩增用引物，所述引物包括上游引物A6180 F和下游引物A6180 R，所述A6180 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述A6180 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0005]本专利技术还提供了一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的测序用引物，所述引物包括上游测序引物和下游测序引物，所述上游测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0006]本专利技术还提供了一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的重组表达载体，所述表达载体的骨架载体为去除了pelB信号肽序列的pET-22b(+)质粒。
[0007]本专利技术还提供了一种表达猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的转化子，所述转化子的宿主菌为BL21。
[0008]优选的是，所述猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0009]本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述转化子的猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的表达方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述的转化子接种于培养基中，培养至OD
600
为0.6～0.8，加入IPTG至浓度为1.0mM，在37℃下诱导培养4h，收获菌体；将菌体与破菌液混合，超声，离心，收集上清液，得到UDP-葡萄糖-4-差向异构酶。
[0010]优选的是，所述破菌液包括免疫印迹及免疫沉淀用裂解液。
[0011]优选的是，所述超声的功率为300W，时间为30min。
[0012]本专利技术还提供了一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的纯化方法，包括以下步骤：
NO.4所示：5
’-
CCCGTTTAGAGGCCCCAAGG-3
’
。在本专利技术中，所述猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因来自猴头菌321，所述猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：ATGGCTGTCGCTGATACCTCTCTTAAACGTGTTTTGGTGACGGGTGGTGCTGGGTACATCGGTTCCCATGTCATTTACGCATTACAGAAGACAAGGCGTTACAAAGTCATCTGTCTTGACAACTACCATAATTCGCAGCCGAAGGCCTTGACACGCCTCGAGCAGATCGCCACCGACGCGCTCCCGGAGGGTGCCACCGCCGACGAAAAGGCGTCCGCAGTCATAGACGTGCACAAGTGCGATCTTACCCAGCCCGAGCAGATCCGAGCAGTCTTCAAGAAGTACGGCAAGGGCGGAATATGGGGAATCATCCACGTCGCGGCCTACAAAGCTGTTGGAGAATCAACAGAGATACCCGTTACCTATTACCACAATAATGTTTCCGCTACCATATTCCTCCTCCAAGTAATGGATGACTTCGACTGCACACGATTCGTATATTCCTCCTCCGCCACCGTCTACGGTACCCCGCCAAAAGTACCCATTCCCGAGTCTACTCGTCTTCAGGCCGACAGCCCTTACGGCAAGAGCAAGGTGATGGCGGAGACGATCATTGATGATTTGACTCACGCCCAACCCACAAGATGGCGAGCTATCTCCCTGCGATACTTCAACCCCGCGGGCGCTCACCCCTCTGGTCTCATCGGTGAGGATCCCCTGGGCCGACCTGGGAATCTGCTGCCCTTGCTGGCCCAGATGGCCGTCGGCCGTGTGAAGGATCCCGTTCTGAAAGTCTTCGGCAACGACTATCCCACCCCAGACGGAACGTGCGTCCGCGACTATCTGCACGTCCTCGACCTGGCCGAGGGCCACCTGCTTGCTCTGGACGCGCTCGCGCCCGAGTCGAAGCTGTTCGACAACTGCCCCACCGAGGCGCGCTACAAGGCGTACAACCTCGGCAGGGGCCAGGGCTCCAGTGTCCTGCAGATCGTCGAGGCCATGCGCAAGGCGACCGGATTCGACTACAAGACCGAGATCGTCGGCAGGAGACGGGGCGATGTCCCAGATCTCACCGCGGACCCGACGCTCGCCGAGAAGGAGCTGGGCTTCAAGGCGAAGCAGGACCTCGAGACCGCCTGCAGGGACCTGTGGAACTGGCAGACGAAGAACCCGAATGGATACGATACCGAGTCGAAGTGA。本专利技术所述测序用引物能够保证后续测序结果的完整性。
[0028]本专利技术还提供了一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的重组表达载体，所述表达载体的骨架载体为去除了pelB信号肽序列的pET-22b(+)质粒。本专利技术所述质粒携带6*HIS标签，能够便于后期蛋白的镍柱纯化。因为pET-22b(+)质粒自身携带了pelB信号肽序列，使得目的蛋白表达后可以储存在周质空间，后期蛋白提取相对繁琐，本专利技术通过去除掉此信号肽序列后进行异源表达蛋白，简化了蛋白提取流程。在本专利技术中，所述猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因来自猴头菌321，所述猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0029]本专利技术还提供了一种表达猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的转化子，所述转化子的宿主菌为BL21。在本专利技术中，所述猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因来自猴本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的扩增用引物，其特征在于，所述引物包括上游引物A6180 F和下游引物A6180 R，所述A6180F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述A6180 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的测序用引物，其特征在于，所述引物包括上游测序引物和下游测序引物，所述上游测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的重组表达载体，所述表达载体的骨架载体为去除了pelB信号肽序列的pET-22b(+)质粒。4.一种表达猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的转化子，其特征在于，所述转化子的宿主菌为BL21。5.根据权利要求1所述扩增用引物或权利要求2所述的测序用引物或权利要求3所述的重组表达载体或权利要求4所述的转化子，其特征在于，所述猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。6.一种基于权利要求5所述转化子的猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的表达方法，包括以下步骤：将权利要求5所述的转化子接种于培...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨焱，任鄄宝，邹根，张赫男，龚明，吴迪，张忠，陈万超，李文，张劲松，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：