一种β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及生化检测领域，特别是涉及一种β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒。

技术介绍

[0002]戈谢病(GD)即葡糖脑苷脂病，是一种家族性糖脂代谢疾病，为染色体隐性遗传，是溶酶体沉积病中最常见的一种。葡糖脑苷脂是一种可溶性的糖脂类物质，是细胞的组成成分之一，在人体内广泛存在。由于葡糖脑苷脂酶的缺乏而引起葡糖脑苷脂在肝、脾、骨骼和中枢神经系统的单核-巨噬细胞内蓄积而发病，产生相应的临床表现。戈谢病在世界各地均有发病。犹太人群发病率较高。我国在1948年首次报道以来，各地均有报告，尤其河北、山东、河南及辽宁病例报告较多。
[0003]戈谢病为常染色体隐性遗传，致病基因位于1号染色体。目前发现位于染色体1q21的GBA基因点突变。GBA基因可见到错义突变、剪接突变、转移突变、基因缺失、基因与假基因融合等，导致葡糖脑苷脂酶的催化功能和稳定性下降，使大量的葡糖脑苷脂在肝、脾、骨骼、肺和脑组织的单核-巨噬细胞中蓄积，形成典型的戈谢细胞。不同的人种基因型的变异不同。少数患者可能为激活蛋白缺陷。
[0004]葡糖脑苷脂酶是一种溶酶体酶，催化D-葡糖-N-酰基鞘氨醇水解，反应生成D-葡萄糖和N-酰基鞘氨醇。戈谢病是一种常染色体隐性遗传性疾病，是由于编码β-葡萄糖脑苷脂酶(GBA)的基因缺陷导致机体葡萄糖脑苷脂酶活性缺乏，造成其底物葡萄糖脑苷脂在肝、脾、骨骼、肺，甚至脑的巨噬细胞溶酶体中贮积而产生的疾病。
[0005]目前，国内临床上诊断戈谢病暂无快速、便捷的诊断试剂产品，通常主要通过基因的突变检测、CT、X线等手段结合典型临床症状如面容改变、皮肤粗糙、关节变形、脏器受累等进行诊断。但针对缺乏典型临床症状的患者，上述手段均不能有效达到早期诊断的目的，且存在操作复杂、费用昂贵、多次反复对患者二次伤害的弊端，也不能作为一种更直接的诊断标准进行该疾病的诊断。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，该试剂盒通过测定滤纸干血片血液样本或静脉血液样本中β-葡糖脑苷脂酶活性，辅助诊断戈谢病患者，具有微量、快速、便捷的特点，解决了目前暂无同类成熟检测试剂盒产品使用的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0008]本专利技术提供一种β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒，包括反应液、沉淀剂、终止液、线性标准品、对照品，其中，所述线性标准品为4-甲基伞形酮溶液，所述反应液为4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖脑苷脂溶液。
[0009]进一步地，所述4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖脑苷脂溶液为酸性溶液，由缓冲液调节pH。
[0010]进一步地，所述4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖脑苷脂溶液的pH为4.0～6.0；
[0011]所述缓冲液为选自醋酸-醋酸钠缓冲液、PBS缓冲液、Goods缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸钠-磷酸氢二钾缓冲液、mops缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、pipes缓冲液和hepes缓冲液中的至少一种。
[0012]进一步地，所述反应液的制备方法为：4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖脑苷脂10mmol加入到纯化水中搅拌充分溶解，加入缓冲液调节溶液的pH为4.0～6.0，定容至1000mL。
[0013]进一步地，所述线性标准品的浓度包括40nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L和500nmol/L。
[0014]进一步地，所述沉淀剂为氢氧化钡、碳酸钠、硫酸锌、氢氧化钠、碳酸氢钠中的一种或几种的混合溶液，所述沉淀剂的离子浓度为0.5mol/L。
[0015]进一步地，所述终止液中为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钡中的一种或几种的混合溶液，所述终止液的离子浓度为0.5mol/L～1.0mol/L。
[0016]进一步地，所述对照品为健康人群的全血样本制备的干血片或纯酶样本。
[0017]进一步地，所述干血片对照品分为阴性对照品、弱阳性对照品和阳性对照品，是通过血细胞和正常人全血样本制备的干血片样本，其中血细胞比容为50～55％，各水平参考品制备方法如下：
[0018]企业参考品组成阴性参考品正常人全血，其中血细胞比容约50％弱阳性参考品20％的正常人全血，其中血细胞比容约50％阳性参考品5％的正常人全血，其中血细胞比容约50％
[0019]进一步地，所述纯酶对照品为β-葡糖脑苷脂酶溶液，各水平参考品制备方法如下：
[0020]β-葡萄糖苷酶初始浓度为2.5U/ml,用0.2ug/ul的BSA溶液分4次稀释到1
×
10-7
U/ml浓度，记为质控品1；用0.2ug/ul的BSA溶液稀释质控品1到5
×
10-8
U/ml浓度，记为质控品2；按照下表用0.2ug/ul的BSA溶液稀释质控品2，分别得到质控品3-8。
[0021][0022]本专利技术公开了以下技术效果：
[0023]本专利技术检测试剂盒的检测分析原理是：
[0024]β-葡糖脑苷脂酶是广泛存在于人体血液中的一种溶酶体酶，β-葡糖脑苷脂酶在酸性条件下能够将人工合成的底物4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖脑苷脂(4-methylumbelliferyl-β-D-glucopyranoside)水解，产生荧光产物4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone)；4-甲基伞形酮在激发波长为360nm，发射波长为460nm条件下可检测到特异的荧光，根据检测的荧光值可计算出β-葡糖脑苷脂酶活力。
[0025]本专利技术基于上述原理开发出了一种可以快速、准确进行人体血样样本中β-葡糖脑苷脂酶的体外诊断试剂盒，通过对采集的滤纸干血片样本或静脉血样本进行检测，可实现批量化快速、便捷、准确辅助诊断戈谢病患者的目的。该试剂盒检测灵敏度高、选择性好、抗
干扰能力强、可重现性好、操作简便、稳定性好，可用于β-葡糖脑苷脂酶的活性检测。
[0026]滤纸干血片的血液样本是当前临床普遍采用的一种血液样本采集的方式，具有操作简便易行，血液需求量少(约20μL/血斑)，易于保存和运输的优点，尤其适用于婴幼儿人群。采用β-葡糖脑苷脂酶荧光底物法对滤纸干血片样本的快速检测技术，不受到干血片样本中所含血细胞的干扰。
具体实施方式
[0027]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0028]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒，其特征在于，包括反应液、沉淀剂、终止液、线性标准品、对照品，其中，所述线性标准品为4-甲基伞形酮溶液，所述反应液为4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖脑苷脂溶液。2.根据权利要求1所述的β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒，其特征在于，所述4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖脑苷脂溶液为酸性溶液，由缓冲液调节pH。3.根据权利要求2所述的β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒，其特征在于，所述4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖脑苷脂溶液的pH为4.0～6.0；所述缓冲液为选自醋酸-醋酸钠缓冲液、PBS缓冲液、Goods缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸钠-磷酸氢二钾缓冲液、mops缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、pipes缓冲液和hepes缓冲液中的至少一种。4.根据权利要求1所述的β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒，其特征在于，所述反应液的制备方法为：4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖脑苷脂10mmol加入到纯化水中搅拌充分溶解，加入缓冲液调节溶液的pH为4.0～6.0，定容至1000mL。5.根据权利要求1所述的β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒，其特征在于，所述线性标准品的浓度包括40nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L和500nmol/L。6.根据权利要求1所述的β-葡糖脑苷脂酶活性的检测试剂盒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永凯，马蒙蒙，唐赞，王瑞，刘立明，卢孟孟，孙杰，胖铁良，李建中，
申请(专利权)人：诺道中科北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：