本发明专利技术涉及一种基于高通量测序的FGFRs基因突变的检测方法及探针序列，包括如下步骤：1)共提取样本基因组DNA及总RNA；2)基因组DNA进行片段化及片段化DNA回收；3)根据总RNA质控情况进行总RNA打断和/或引物杂交；3)合成cDNA第一链；4)合成cDNA第二链；5)将片段化后的DNA与cDNA混合构建混合文库；6)采用捕获探针进行杂交和捕获；7)捕获后文库扩增及纯化；8)高通量测序及突变分析。本发明专利技术能够检测FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4基因单碱基突变、插入缺失突变及融合突变及相对表达量分析。突变及融合突变及相对表达量分析。
【技术实现步骤摘要】
一种基于高通量测序的FGFRs基因突变的检测方法及探针序列
[0001]本专利技术涉及一种基于高通量测序平台开发的FGFRs(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)基因突变检测方法。
技术介绍
[0002]成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)是高度保守，分布广泛的跨膜酪氨酸激酶受体。它们参与发育，分化，细胞存活，迁移，血管生成和致癌作用。目前，国内外顶尖药企，正在研发多种FGFR靶向药，包括Erdafitinib(厄达替尼)、BGJ398、AZD4547和BLU-554等第一代药物，其中Erdafitinib已经获批上市，同时针对一代耐药后的第二代FGFR靶向药TAS-120也都处于临床评估阶段，针对这些靶向药物的用药靶点的伴随诊断临床检测需求也日渐旺盛。在人类中，有四种FGFR典型的酪氨酸激酶受体(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR14)，2015年在clinical cancer research期刊中发表了用下一代测序技术描述了来自各种癌症的4853个患者样品中FGFR的突变情况，包括突变，融合和扩增。在测序的4853种癌症中，该研究观察到343例病例中有360个FGFR突变，共涉及17个癌种，总发生率为7.1％。在360个FGFR突变中，点突变及插入缺失突变点基因约占26％，基因融合突变约占8％。
[0003]基于FGFRs基因突变类型的多样性，包括点突变、插入缺失突变、融合突变、扩增/过表达突变，临床的检测需求也是多样的，需要一种能够检测FGFRs多种突变类型的方法；同时受限于样品量，样本质量不高，以及考虑到终端检测应用的经济性。现有FGFRs基因突变检测方法有诸多不足之处。
[0004]基于荧光原位杂交(FISH)的FGFR2基因融合突变检测技术是先根据FGFR2基因上下游分别设计5
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端探针组及3
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端探针组，并标记不同荧光基团，通过观察显微镜下原位杂交的荧光信号分离程度，判别是否发生融合突变。该方法仅能用于鉴别FGFR2基因是否发生了融合突变，无法确定融合伴侣基因及具体断点位置，也无法检测FGFRs基因的点突变、插入缺失突变等其他突变类型。
[0005]基于单独的依靠DNA样本的扩增子或靶向捕获高通量检测技术通过设计FGFRs基因CDS区域的扩增引物或捕获探针，也可以实现对FGFRs基因点突变、插入缺失突变的检测，但对于融合突变检测，扩增子靶向测序技术，仅能够根据已知融合断点设计扩增引物，无法适用于融合发生于内含子区域的断点未知的DNA样本，且对样本质量也有一定要求；而对于靶向捕获测序技术，理论上捕获探针需要覆盖基因的所有内含子区域，才能覆盖所有的FGFRs基因的融合突变类型，检测区域相比于仅检测CDS区扩大15倍，预期的测序数据量及测序成本也将增加15倍，导致检测成本过高，经济性差。
[0006]基于分别依靠DNA样本及RNA样本进行的靶向捕获高通量检测技术，可以对DNA外显子区域设计扩增引物或捕获探针，实现点突变、插入缺失突变的检测，对于采用RNA样本进行融合突变检测的扩增子靶向测序技术，仅能够根据已知融合断点设计扩增引物，实现已知融合突变类型的检测，不能检测未知的融合突变；而对于靶向捕获测序技术，可以实现
已知融合突变及未知融合突变的检测，但2种样本类型均需要分别进行杂交捕获步骤，导致检测操作复杂，检测成本加倍，适用性及经济性较差。
[0007]综上所述，目前FGFRs突变检测方法还不够成熟，可用的检测方法，受限于本身技术原理不适用，检测突变类型不全，检测成本过高或检测操作过于复杂，无法满足日益增长的检测需求，因此，急需一种检测突变类型全面，检测成本低，检测步骤较为简单，能够满足FGFRs临床检测需求的方法。
技术实现思路
[0008]本专利技术的主要目的，在于提供一种基于高通量测序平台开发的FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4基因突变检测方法。本专利技术通过以下技术方案实现：
[0009]根据FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4编码区序列，经过长期大量的试验研究，设计、筛选出一种检测FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4基因点突变、插入缺失突变、融合突变及相对表达量分析的捕获探针及杂交捕获洗脱体系，包括但不限于SEQ ID No：1～20所示的核苷酸序列。
[0010]SEQ ID No.探针序列
[0011][0012]注：MT/C/G-Biotin为生物素修饰碱基
[0013]根据各看家基因的编码区序列及内含子序列，经过长期大量的数据库调研，试验研究，设计、筛选出捕获探针包含TBC1D10B、VCP、VPS29、RAB7A、TBP、EMC7、CHMP2A、CHMP2A、CHMP2A、POLR2A、ABCF1、PSMB2、MRPL13、UBB、OAZ1、GPI、PSMB4、HMBS、GAPDH、STK11IP、G6PD、SNRPD3、HPRT1等看家基因的外显子交界区域的捕获探针，以及这些看家基因内含子区域的捕获探针及杂交洗脱体系，包括但不限于SEQ ID No：21～30所示的核苷酸序列。
[0014]建立一套构建DNA及cDNA混合文库的建库体系，实现打断后的DNA与cDNA在同一反应体系中进行末端修复及接头连接反应。
[0015]设计一种基于高通量测序平台开发的FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4基因突变检测方法，包括以下步骤：
[0016]1)合成上述探针，并在探针序列的5
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或3
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端进行生物素标记；
[0017]2)共抽提组织FFPE样本的基因组DNA及总RNA并质控：
[0018]3)基因组DNA片段化：采用共聚焦超声或DNA消化酶，对基因组DNA进行片段化处理
[0019]4)根据总RNA质控情况进行总RNA打断和/或引物杂交；
[0020]5)cDNA合成：以总RNA为模板，合成cDNA第一链，以第一链cDNA为模板，合成cDNA第二链；
[0021]6)构建DNA及cDNA混合文库：取片段化后的DNA产物，与纯化后的cDNA产物混合，加入末端修复缓冲液和末端修复酶混合物进行末端修复反应；反应完成后加入接头、连接缓冲液、增强子及无核酶水进行连接反应；产物纯化后，加入标签引物进行文库扩增反应，经纯化后得到DNA及cDNA混合文库，对文库进行定量和质控；
[0022]7)杂交和捕获；取构建好的DNA及cDNA混合文库文库，加入杂交缓冲液和FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4基因及质控内参基因捕获探针进行杂交和捕获；
[0023]8)捕获后文库扩增及纯化；在捕获的回收产物中加入扩增引物和扩增酶进行文库扩增，纯化回收产物；
[0024]9)高通量测序：对扩增后的文库定量和质控后进行高通量测序。
[0025]10)测序结果分析：对测序后的结果进行序列分析，输出FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGF本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序的FGFRs基因突变的检测方法，所述的FGFRs基因包括FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4，其特征在于，包括如下步骤：1)共抽提组织FFPE样本的基因组DNA及总RNA并质控：2)对基因组DNA进行片段化处理；3)根据总RNA质控情况进行总RNA打断和/或引物杂交；4)cDNA合成：以总RNA为模板，合成cDNA第一链，再以第一链cDNA为模板，合成cDNA第二链；5)构建DNA及cDNA混合文库：取片段化后的DNA产物，与纯化后的cDNA产物混合，加入末端修复缓冲液和末端修复酶混合物进行末端修复反应；反应完成后加入接头进行连接反应；产物纯化后，加入标签引物进行文库扩增反应，经纯化后得到DNA及cDNA混合文库，对文库进行定量和质控；6)杂交和捕获；取构建好的DNA及cDNA混合文库，加入杂交缓冲液和FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4基因及质控内参基因捕获探针进行杂交和捕获；7)捕获后文库扩增及纯化；在捕获的回收产物中加入扩增引物和扩增酶进行文库扩增，纯化回收产物；8)高通量测序：对扩增后的文库定量和质控后进行高通量测序；9)测序结果分析：对测序后的结果进行序列分析，得到FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4基因单碱基突变、插入缺失突变及融合突变信息及FGFRs基因的相对表达量信息。2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的FGFRs基因突变的检测方法，其特征在于：步骤1)中所述共抽提为基因组DNA及总RNA共抽提，对被抽提样本进行单次核酸抽提，分别获得基因组DNA及总RNA。3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的FGFRs基因突变的检测方法，其特征在于：步骤1)中所述样本为RNA降解严重的样本，包括福尔马林固定石蜡包埋的样本。4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的FGFRs基因突变的检测方法，其特征在于：步骤3)中，对于DV200大于等于30％的RNA样品，取检测合格的RNA样本100ng，加入4μl 5
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第一链合成缓冲液和1μl随机引物，并用Nuclease-free H2O补齐至总体积18ul，置于PCR仪上，按照以下程序进行打断和引物杂交反应：94℃8min，4℃保持，热盖105℃；对于RNA样本的DV200小于30％的RNA样品，取RNA样本500ng，加入1μl随机引物，并用Nuclease-free H2O补齐至总体积1...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈学俊，黄红伟，石银，郑立谋，
申请(专利权)人：厦门艾德生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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