一种利用KASP标记鉴定亚洲棉的花基红斑性状的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用KASP标记鉴定亚洲棉的花基红斑性状的方法。所述方法包括以下步骤：步骤1，提取亚洲棉基因组DNA；步骤2，开发亚洲棉花基红斑KASP标记；步骤3，KASP基因分型，KASP

【技术实现步骤摘要】
一种利用KASP标记鉴定亚洲棉的花基红斑性状的方法


[0001]本专利技术涉及棉花分子育种应用领域，具体而言，涉及一种利用KASP标记鉴定亚洲棉的花基红斑性状的方法。

技术介绍

[0002]我国种植亚洲棉有两千年以上的历史，亚洲棉具有早熟、耐旱、抗病虫等特点，且易种、好管、虫害少，亚洲棉纤维粗短、强力高，既适于制作棉被和土布，又适于织灯芯绒、拉绒布、混纺地毯。且亚洲棉花色多样，颜色绚丽，极具观赏价值，在庭院花园兴起后，其综合价值将进一步凸显。花基红斑性状指当亚洲棉的花蕾盛开后，花瓣为乳白色，而花瓣底端有深红色花斑，该性状颜色艳丽，易于分辨，直到花瓣凋谢干枯时花斑仍能清晰分辨。
[0003]现有技术中，利用具有花基红斑性状的纯系品种和不具有花基红斑性状的品种杂交，可根据花基红斑的比例鉴别杂交种真伪和纯度，即花基红斑性状可作为指示性状用于杂交棉真伪和纯度检验。
[0004]例如中国专利公开号为CN102057862A的专利技术专利公开了一种陆地棉花基红斑标记性状的应用，其是使用具有花基红斑标记性状的杂交棉亲本或纯系品种作为父本或母本，与具有或不具有花基红斑标记性状的其它杂交棉亲本和纯系品种进行杂交，生产杂交种，生产的杂交种播种后，根据花基红斑的比例直观鉴别和检验杂交种真伪和纯度；所述的具有花基红斑标记性状的杂交棉亲本包括两系不育系、三系不育系、保持系和恢复系。该专利技术可以有效控制棉花种子生产质量，避免假冒伪劣和纯度差的种子冲击市场，为生产、销售合格种子提供技术支撑和保护，以维护企业和农民的合法权益，促进棉种产业的健康发展，具有很高的应用价值。
[0005]现有技术中至少存在以下问题：
[0006]由于亚洲棉从播种到开花至少需要两个月，且开花还受季节、光照和温度影响，作为指示性状无法达到早期预测的目的。因此，借助分子标记技术，寻找一种利用种子或者幼苗鉴定亚洲棉花基红斑的方法，对该性状在杂交种真实度和纯度鉴定上的应用具有重要意义。
[0007]针对现有技术中由于亚洲棉从播种到开花至少需要两个月，且开花还受季节、光照和温度影响，作为指示性状无法达到早期预测的目的的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种利用KASP标记鉴定亚洲棉花基红斑性状的方法。
[0009]所述方法包括以下步骤：
[0010]步骤1，获取亚洲棉基因组DNA：
[0011]步骤1.1，提取，将亚洲棉置于液氮预冷的2ml离心管中，放入2颗直径8mm小钢珠，
加入750ml的CTAB提取液，用转速1800r/min的研磨机研磨8min，取出后，置于冰上放置5min；
[0012]步骤1.2，裂解，利用离心机在4℃下12000r/min离心15min，将离心管倾斜流出上部液体，弃上清，取出1颗钢珠，加入750ml裂解液，将离心管置于泡沫浮漂上在65℃水浴30-45min，每5min晃动离心管15s；
[0013]步骤1.3，抽提，冷却至室温，加入等量氯仿/异戊醇(24:1)轻缓颠倒混匀，5000r/min离心15min，取上清，并重复再抽提一次；
[0014]步骤1.4，沉淀，将异丙醇在-20℃冰箱中预冷2小时，取步骤1.3中上清液2/3体积的异戊醇分装到1.5ml离心管中，将上清液注入异戊醇中，颠倒混匀，在-20℃冰箱静置20min，当出现白色絮状沉淀时，10000r/min离心10min，倾斜离心管，弃上清液；
[0015]步骤1.5，清洗，向离心管内加入70％乙醇，震动离心管下部，将附着在离心底的DNA沉淀弹起并晃动离心管，置于离心机中，5000r/min离心1min，倾斜离心管弃上清，利用70％乙醇重复洗涤沉淀2次，100％乙醇清洗1次，置于通风橱风干；
[0016]步骤1.6，定容，将风干后的DNA沉淀溶于30-40ul超纯水中，加入核糖核酸酶，常温放置1h，后置于4℃冰箱备用；
[0017]步骤2，开发亚洲棉花基红斑KASP标记：
[0018]步骤2.1，对25个非同义突变位点和3个移码突变位点在花基红斑分离群体中进行检测，其中，有5个位点与花基红斑性状紧密连锁，分别命名为Ga27640-C/CAA(INDEL4),Ga27640-T/G(SNP11),Ga27646-A/G(SNP17),Ga27648-A/T(SNP18),Ga27650-C/G(SNP22)；
[0019]步骤2.2，针对步骤2.1中与花基红斑性状紧密连锁的5个位点分别进行KASP标记开发，利用Primer3根据SNP位点设计PCR 3
’
末端扩增引物，引物Tm值在55～65℃之间，每个SNP位点设计两条SNP特异性引物和一条通用引物；
[0020]步骤3，KASP基因分型，KASP-PCR反应在Douglas Array Tape平台上进行：
[0021]步骤3.1，在NEXAR液体处理工作站上DNA和PCR mix加入array tape，在SOELLEX高通量PCR水浴中完成PCR反应；
[0022]步骤3.1.1，PCR反应成分包括Master Mix和引物Mix：
[0023]Master Mix包括：FAMTM和HEXTM特殊荧光共振能量转移基团、经过修饰的Taq酶，用于扩增等位特异碱基和反应缓冲液；
[0024]引物Mix包括：两条正向序列等位特异引物，每条引物5
’-
端都含有一段未经过荧光标记的接头序列和一条反向序列引物；
[0025]步骤3.1.2，PCR反应体系：
[0026]DNA分装到PCR反应容器后，LGC平台将分装好的DNA在烘箱65℃放置30min进行烘干；
[0027]步骤3.1.3，PCR反应程序：
[0028]步骤3.1.3.1，在94℃的温度下进行变性，变性时间为15mins；
[0029]步骤3.1.3.2，富集含有SNP位点的模板DNA，在94℃的温度下进行变性，变性时间为20s,在55-61℃的温度下进行退火/延伸，60S梯度退火，每个循环降低0.6℃，重复15个循环；
[0030]步骤3.1.3.3，荧光信号放大，在94℃的温度下进行变性，变性时间为20s,在55℃
的温度下进行退火/延伸，60S梯度退火，重复26个循环；
[0031]步骤3.2，ARAYA荧光阅读仪上读取荧光信号，当KASP检测PCR反应程序完成时，将384孔板和Tape分别放置到Omega荧光信号阅读仪和Araya荧光检测系统，Araya荧光检测系统将荧光信号转变为碱基基因型，并采用KrakenTM进行基因型分析；
[0032]步骤3.3，将荧光信号结果导入数据库在Douglas Scientific Dashboard，按照分型明确、NTC无特异性扩增的原则进行样品SNP分型；
[0033]步骤4，KASP分子标记判定花基红斑性状：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用KASP标记鉴定亚洲棉的花基红斑性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，获取亚洲棉基因组DNA；步骤2，开发亚洲棉花基红斑KASP标记：步骤2.1，对25个非同义突变位点和3个移码突变位点在花基红斑分离群体中进行检测，其中，有5个位点与花基红斑性状紧密连锁，分别命名为Ga27640-C/CAA(INDEL4),Ga27640-T/G(SNP11),Ga27646-A/G(SNP17),Ga27648-A/T(SNP18),Ga27650-C/G(SNP22)；步骤2.2，针对步骤2.1中与花基红斑性状紧密连锁的5个位点分别进行KASP标记开发，利用Primer3根据SNP位点设计PCR 3
’
末端扩增引物，引物Tm值在55～65℃之间，每个SNP位点设计两条SNP特异性引物和一条通用引物；步骤3，KASP基因分型，KASP-PCR反应在Douglas Array Tape平台上进行；步骤4，KASP分子标记判定花基红斑性状：标记Ga27640-C/CAA(INDEL4)，若检测位点基因型为CAA/CAA，则为无花基红斑；若为C/C，则为有花基红斑纯合型；若为C/CAA，则为有花基红斑杂合型；标记Ga27640-T/G(SNP11)，若检测位点基因型为G/G，则为无花基红斑；若为T/T，则为有花基红斑纯合型；若为G/T，则为有花基红斑杂合型；标记Ga27646-A/G(SNP17)，若检测位点基因型为G/G，则为无花基红斑；若为A/A，则为有花基红斑纯合型；若为A/G，则为有花基红斑杂合型；标记Ga27648-A/T(SNP18)，若检测位点基因型为T/T，则为无花基红斑；若为A/A，则为有花基红斑纯合型；若为A/T，则为有花基红斑杂合型；标记Ga27650-C/G(SNP22)，若检测位点基因型为G/G，则为无花基红斑；若为C/C，则为有花基红斑纯合型；若为C/G，则为有花基红斑杂合型。2.根据权利要求1所述的利用KASP标记鉴定亚洲棉的花基红斑性状的方法，其特征在于，步骤1所述获取亚洲棉基因组DNA包括以下步骤：步骤1.1，提取，将亚洲棉置于液氮预冷的2ml离心管中，放入2颗直径8mm小钢珠，加入750ml的CTAB提取液，用转速1800r/min的研磨机研磨8min，取出后，置于冰上放置5min；步骤1.2，裂解，利用离心机在4℃下12000r/min离心15min，将离心管倾斜流出上部液体，弃上清，取出1颗钢珠，加入750ml裂解液，将离心管置于泡沫浮漂上在65℃水浴30-45min，每5min晃动离心管15s；步骤1.3，抽提，冷却至室温，加入等量氯仿/异戊醇(24:1)轻缓颠倒混匀，5000r/min离心15min，取上清，并重复再抽提一次；步骤1.4，沉淀，将异丙醇在-20℃冰箱中预冷2小时，取步骤1.3中上清液2/3体积的异戊醇分装到1.5ml离心管中，将上清液注入异戊醇中，颠倒混匀，在-20℃冰箱静置20...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建宏，张素君，张香云，刘存敬，唐丽媛，李兴河，王海涛，蔡肖，
申请(专利权)人：河北省农林科学院棉花研究所河北省农林科学院特种经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：