一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，取密度为2.9

【技术实现步骤摘要】
一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法


[0001]本专利技术属于新冠重组ACE2蛋白
，具体为一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法。

技术介绍

[0002]2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，2020年1月12日，世界卫生组织正式将其命名为2019-nCoV。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。
[0003]ACE2是2019-nCoV冠状病毒的主要受体。此研究旨在鉴定ACE2的2019-nCoV受体功能区,为进一步阐明2019-nCoV与细胞间的相互作用机制及研制抗病毒药物等提供理论依据。
[0004]现在技术中，如何利用哺乳动物Expi293表达系统表达ACE2蛋白并通过一步离子交换层析得到最终蛋白，为2019-nCoV免疫抗体的制备和体外检测及后续疫苗的研究开发奠定了基础是现在技术需要克服的难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就在于为了解决现在技术中，如何利用哺乳动物Expi293表达系统表达ACE2蛋白并通过一步离子交换层析得到最终蛋白，为2019-nCoV免疫抗体的制备和体外检测及后续疫苗的研究开发奠定了基础是现在技术需要克服的难题，而提出一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，包括以下步骤：
[0008]第一步：重组质粒构建：通过基因合成技术将重组ACE2全长基因进行密码子优化后亚克隆到pcDNA3.1载体中，构建ACE2重组质粒；
[0009]第二步：转染：取密度为2.9
×
10
6-3.1
×
106/mL存活率为95-99％的Expi293细胞接种三角瓶；
[0010]用Opti-MENⅠ稀释准备好的ACE2重组质粒，再用Opti-MENⅠ稀释准备好的ExpiFectamin293Regent，室温静置4-6min；
[0011]将稀释后的ExpiFectamin293Regent加入至稀释后的ACE2重组质粒中，混匀2-3次后室温静置28-32min，得到混合物；
[0012]将混合物加入至事先备好的细胞中，在温度35-39℃、转速为110-130rpm、CO2的浓度为6％-10％的培养箱中培养4-5天；
[0013]第三步：收样及纯化：收集培养基，利用SephroseG25对培养基进行缓冲液的置换后，再利用离子交换层析技术得到最终蛋白；
[0014]第四步：活性测定：利用Biacore检测最终蛋白的活性。
[0015]优选的，在第四步中,活性检测包括：配体偶联、重组ACE2重组质粒浓度、参数选择、分析模式。
[0016]优选的，配体偶联包括4通道偶联ACE2为3000RU；3通道偶联BSA为3000RU。
[0017]优选的，重组ACE2重组质粒浓度分别为0.03125ug/mL、0.0625ug/mL、0.125ug/mL、0.25ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL。
[0018]优选的，参数选择包括流速为30ug/mL、结合40s、解离300s、无需再生。
[0019]优选的，分析模式为1:1binding。
[0020]优选的，ACE2重组质粒蛋白序列为：
[0021]MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS*。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023]重组质粒构建：通过基因合成技术将重组ACE2全长基因进行密码子优化后亚克隆到pcDNA3.1载体中，构建ACE2重组质粒；构建ACE2重组质粒时，未加任何标签，因此后期蛋白表达时不会有任何氨基酸残留，从而减少了其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成的干扰；重组质粒构建时，将密码子进行优化，使用高表达的Expi293系统对目的蛋白进行表达，极大的提高了目的蛋白的表达量；
[0024]转染：取密度为2.9
×
10
6-3.1
×
106/mL存活率为95-99％的Expi293细胞接种三角瓶；
[0025]用Opti-MENⅠ稀释准备好的ACE2重组质粒，再用Opti-MENⅠ稀释准备好的ExpiFectamin293Regent，室温静置4-6min；
[0026]将稀释后的ExpiFectamin293Regent加入至稀释后的ACE2重组质粒中，混匀2-3次后室温静置28-32min，得到混合物；
[0027]将混合物加入至事先备好的细胞中，在温度35-39℃、转速为110-130rpm、CO2的浓度为6％-10％的培养箱中培养4-5天；
[0028]收样及纯化：收集培养基，利用SephroseG25对培养基进行缓冲液的置换后，再利用离子交换层析技术得到最终蛋白；一步离子交换层析，保证纯化时间再2h内，低温操作，极大地保证了蛋白活性；
[0029]活性测定：利用Biacore检测最终蛋白的活性；利用Biacore检测活性，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步：重组质粒构建：通过基因合成技术将重组ACE2全长基因进行密码子优化后亚克隆到pcDNA3.1载体中，构建ACE2重组质粒；第二步：转染：取密度为2.9
×
10
6-3.1
×
106/mL存活率为95-99％的Expi293细胞接种三角瓶；用Opti-MEN
ꢀⅠ
稀释准备好的ACE2重组质粒，再用Opti-MEN
ꢀⅠ
稀释准备好的ExpiFectamin293Regent，室温静置4-6min；将稀释后的ExpiFectamin293Regent加入至稀释后的ACE2重组质粒中，混匀2-3次后室温静置28-32min，得到混合物；将混合物加入至事先备好的细胞中，在温度35-39℃、转速为110-130rpm、CO2的浓度为6％-10％的培养箱中培养4-5天；第三步：收样及纯化：收集培养基，利用SephroseG25对培养基进行缓冲液的置换后，再利用离子交换层析技术得到最终蛋白；第四步：活性测定：利用Biacore检测最终蛋白的活性。2.根据权利要求1所述的一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于，在第四步中,活性检测包括：配体偶联、重组ACE2重组质粒浓度、参数选择、分析模式。3.根据权利要求2所述的一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于，配体偶联包括4通道偶联ACE2为3000RU；3通道偶联BSA为3000RU。4.根据权利要求2所述的一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于，重组ACE2重组质粒浓度分别为0.03125ug/mL、0.0625ug/mL、0.125ug/mL、0.25ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL。5.根据权利要求2所述的一种新冠重组ACE2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于，参数选择包括流速为30ug/mL、结合40s...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，李森，邹刚刚，王方平，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：