一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法，飞秒激光脉冲振荡器产生的超短脉冲依次经脉冲压缩器、超陡长通滤波片、分束镜和物镜后照射在放置于二维精密可调平台上的待测样品上，分束镜的一侧设置有第一光谱仪；散射信号经待测样品的透射部分经聚光透镜收集，然后经第二分束镜分两路，一路依次连接第一超陡短通滤波片、透镜和第二光谱仪，用于进行CARS光谱测量；另一路依次经陷波滤波片、第二超陡短通滤波片、光电倍增管和锁相放大器后用于锁相放大成像。装置简单、廉价、易操作，信噪比高，平均入射光功率低。平均入射光功率低。

【技术实现步骤摘要】
一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法


[0001]本专利技术属于振动模式和细胞结构检测
，具体涉及一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法。

技术介绍

[0002]拉曼散射显微技术作为检测振动模式和分子结构最有用的光学技术之一，已经得到了广泛应用。然而自发拉曼散射(SPRS)由于自身信号强度的问题，SPRS在生物医学的快速成像方面有很大的局限。相比之下，荧光显微技术的发展如日中天。荧光显微镜能够得到广泛的应用主要得力于两点：第一，由于高灵敏度，荧光显微镜可以实现单分子荧光成像，通过多焦点成像，荧光显微镜的分辨率得到大幅度提升。第二，多种可选用的荧光探针，使得荧光显微技术的功能更加多样化，可以应用于各种生命体的观测。然而荧光显微镜有着其不可避免的内在局限。首先，荧光标记虽然对于大分子物质有着良好的靶向作用，但其对于小分子的生命物质很难做到有效的标记，因此特异性较差。其次，作为外源标记物的荧光探针对生命体细胞的活性有着一定的损伤，甚至引起细胞组织的光致漂白等问题。
[0003]相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)的信号强度相比SPRS要高5，6个数量级，在生物医学领域，尤其是在活细胞成像方面有着广泛应用。CARS是一个由泵浦光，斯托克斯光，反斯托克斯光以及样品分子相互作用的一个四波混频(four wave mixing，FWM)的光学过程，属于三阶非线性光学过程。频率为ωp的泵浦光将样品分子激发到一个虚能级，频率为ωS的斯托克斯光再将样品分子激发到一个振动能级，该过程需要满足相位匹配即样品分子的固有振动频率Ω＝ωp-ωS。此时，样品分子的能量升高，再用频率为ωpr的探测光(probe)将样品分子激发到一个能量更高的虚能级，样品分子的能量不稳定回到基态，释放出频率为ωaS的反斯托克斯光子，该过程同样满足一定的条件Ω＝ωaS-ωpr。因此，相比荧光显微镜，CARS显微镜具有良好的特异性功能。CARS一般使用多光束或多光源方案(以满足泵浦光子，斯托克斯光子以及探测光子的频率成分要求)来实现，要求所有激发光束必须在空间上重合。
[0004]为简化CARS系统，使用陷波滤波片可以实现更简单的单光束CARS方法。通过在激光光谱上创建陷波特征(ωpr)，并在CARS谱上产生类似(尽管略微较弱)的特征(ωaS)。由于陷波滤波片的小巧、简单，容易安装于振镜扫描仪上对激光进行高频调制(高达几个kHz)。由于共振信号位置只与陷波频率位置pr有关，因此，可以利用自外差方法将非共振信号作为本地振荡器，除去非共振信号的同时放大较弱的共振信号。重要的是，这种方法可以用于所有基于光纤组件实现的CARS方案。这种方法还可以很容易地扩展到实现低频CARS光谱和显微镜，这对于研究大生物分子的低频振动模式很重要。
[0005]相比普通的多光束CARS和基于脉冲整形器实现的单光束CARS方案而言，上述基于陷波滤波片实现的单光束CARS方案要简单、紧凑的多。然而，陷波滤波片的引入，使得该系统仍然比较昂贵，相对复杂。人们利用超陡滤波片人们可以将陷波滤波片移出单光束CARS系统外，而且证明这种CARS光谱性价比更高，系统更加简单、易操作；然而，这种装置只限于
测量拉曼光谱还不能实现振动成像，而且灵敏度有限。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法，利用荧光增强的方法进一步提高单光束CARS系统的灵敏度，并且将超陡长通滤波片安装于振镜扫描仪上以实现振动成像，以简化振动成像装置。
[0007]本专利技术采用以下技术方案：
[0008]一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置，包括飞秒激光脉冲振荡器，飞秒激光脉冲振荡器产生的超短脉冲依次经脉冲压缩器、超陡长通滤波片、分束镜和物镜后照射在放置于二维精密可调平台上的待测样品上，分束镜的一侧设置有第一光谱仪；散射信号经待测样品的透射部分经聚光透镜收集，然后经第二分束镜分两路，一路依次连接第一超陡短通滤波片、透镜和第二光谱仪，用于进行CARS光谱测量；另一路依次经陷波滤波片、第二超陡短通滤波片、光电倍增管和锁相放大器后用于锁相放大成像。
[0009]具体的，超短脉冲的中心波长为793～808nm，带宽为40～70nm，重复频率为80MHz，脉宽为5～20fs。
[0010]具体的，透镜的焦距为30m～100mm。
[0011]本专利技术的另一个技术方案是，一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像方法，利用所述的成像装置，全电子共振的相干反斯托克斯拉曼散射光谱方法具体步骤如下：
[0012]S1、启动飞秒激光脉冲，粗调物镜的焦点使激光聚焦于样品上，直至从第二光谱仪或光电倍增管看到原始CARS信号，同时调节反射镜和聚光透镜的位置，使第二光谱仪测量的CARS光谱强度最大；
[0013]S2、优化脉冲压缩器中棱镜对的相对位置使得样品上激光的色散被补偿，直到原始CARS信号不能增大为止；
[0014]S3、观测第二光谱仪测量的CARS光谱强度，调节分束镜使得激光与物镜至所观测的原始CARS信号不再增大为止；
[0015]S4、调节光谱仪的光纤角度使第二光谱仪所观测的原始CARS信号不再增大为止，使光耦合效率达到最高值。
[0016]具体的，步骤S1中，通过调节二维支架调节物镜的焦点位置、激光的俯仰角度以及准直度。
[0017]具体的，步骤S2中，调节一维精密平移台改变棱镜位置，同时利用第二光谱仪观测原始CARS光谱强度的变化，直至CARS光谱强度不再增大。
[0018]具体的，步骤S3中，观测第二光谱仪测量的CARS光谱强度，调节固定分束镜支架使得所观测的原始CARS信号不再增大为止，此时激光与物镜匹配到最佳位置。
[0019]具体的，步骤S4具体为：
[0020]S401、调节超陡长通滤波片的角度，利用第一光谱仪观测超陡长通滤波片截断边沿的波长，当边沿波长为780nm时，利用第二光谱仪记录原始CARS光谱数据I1；
[0021]S402、调节超陡长通滤波片的角度，当截断边沿波长为780.3～781nm时，利用第二光谱仪记录第二组原始CARS光谱数据I2；
[0022]S403、将所得两组原始CARS光谱进行微分便得到待测样品的拉曼光谱，以横轴为振动频率，纵轴为CARS光谱强度，利用Matlab画图得到不同振动频率的强度变化。
[0023]更进一步的，步骤S403中，待测样品的拉曼光谱IRaman如下：
[0024][0025]其中，
[0026]本专利技术的另一个技术方案是，一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像方法，利用所述的成像装置，全电子共振的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像方法具体步骤如下：
[0027]S5、准备经过IR783染色的细胞，并将染色细胞放置于载玻片上；
[0028]S6、利用陷波滤波片选择感兴趣的IR783的振动模式；选择方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置，其特征在于，包括飞秒激光脉冲振荡器(1)，飞秒激光脉冲振荡器(1)产生的超短脉冲依次经脉冲压缩器(2)、超陡长通滤波片(3)、分束镜(4)和物镜(6)后照射在放置于二维精密可调平台上的待测样品(7)上，分束镜(4)的一侧设置有第一光谱仪(5)；散射信号经待测样品(7)的透射部分经聚光透镜(8)收集，然后经第二分束镜(9)分两路，一路依次连接第一超陡短通滤波片(10)、透镜(11)和第二光谱仪(12)，用于进行CARS光谱测量；另一路依次经陷波滤波片(13)、第二超陡短通滤波片(14)、光电倍增管(15)和锁相放大器(16)后用于锁相放大成像。2.根据权利要求1所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置，其特征在于，超短脉冲的中心波长为793～808nm，带宽为40～70nm，重复频率为80MHz，脉宽为5～20fs。3.根据权利要求1所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置，其特征在于，透镜(11)的焦距为30m～100mm。4.一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像方法，其特征在于，利用权利要求1所述的成像装置，全电子共振的相干反斯托克斯拉曼散射光谱方法具体步骤如下：S1、启动飞秒激光脉冲，粗调物镜的焦点使激光聚焦于样品上，直至从第二光谱仪或光电倍增管看到原始CARS信号，同时调节反射镜和聚光透镜的位置，使第二光谱仪测量的CARS光谱强度最大；S2、优化脉冲压缩器中棱镜对的相对位置使得样品上激光的色散被补偿，直到原始CARS信号不能增大为止；S3、观测第二光谱仪测量的CARS光谱强度，调节分束镜使得激光与物镜至所观测的原始CARS信号不再增大为止；S4、调节光谱仪的光纤角度使第二光谱仪所观测的原始CARS信号不再增大为止，使光耦合效率达到最高值。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，通过调节二维支架调节物镜的焦点位置、激光的俯仰角度以及准直度。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，调节一维精密平移台改变棱镜位置，同时利用第二光谱仪观测原始CARS光谱强度的变化，直至CARS光谱强度不再增大。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中，观测第二光谱仪测量的CARS光谱强度，调...

【专利技术属性】
技术研发人员：任立庆，蒲禹奇，李保国，黄伟尧，郭少康，张明震，陈姚宇，杨健，王国章，
申请(专利权)人：榆林学院，
类型：发明
国别省市：