一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗PD

【技术实现步骤摘要】
学活性。

技术实现思路
：
[0007]本专利技术的目的在于提供一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法，该方法操作简单， 专属性强，精密度和准确度高，对于抗PD-1单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要意义。
[0008]本专利技术提供了一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法，所述的方法包括以下步骤：
[0009](1)封闭、洗板：用封闭液将96孔MSD高结合板封闭1-3小时，PBS缓冲液洗板；
[0010](2)孵育：依次加入PD-1/CHO-S细胞、PD-L1-mFc、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测 抗体，以及系列梯度浓度的参考品和待测样品，室温中避光孵育1-1.5h；
[0011]所述的参考品和待测样品为抗PD-1单克隆抗体；
[0012](3)读板：加入2
×
读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；
[0013](4)数据处理：分别对参考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50 值，计算得到待测样品的生物学活性。
[0014]优选地，所述的PD-1/CHO-S细胞的接种密度为4.0-6.0
×
104个细胞/孔；进一步优选地， PD-1/CHO-S细胞的接种密度为5.0
×
104个细胞/孔。
[0015]优选地，所述的PD-L1-mFc的浓度为120-160ng/mL；进一步优选地，PD-L1-mFc的浓 度为140ng/mL。
[0016]优选地，所述的SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体浓度为0.8-1.2μg/mL；进一步优选 地，SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体浓度为1.0μg/mL
[0017]优选地，所述的参考品和待测样品浓度为0-2000ng/mL。
[0018]优选地，所述的读板缓冲液为100μL/孔的PBS溶液。
[0019]具体地，一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法包括以下步骤：
[0020](1)封闭、洗板：用封闭液将96孔MSD高结合板封闭1-3小时，PBS缓冲液洗板；
[0021](2)孵育：接种PD-1/CHO-S细胞，接种密度为4.0-6.0
×
104个细胞/孔，加入PD-L1-mFc 120-160ng/mL、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体0.8-1.2μg/mL，以及系列梯度浓度的参考 品和待测样品，室温中避光孵育1-1.5h；
[0022]所述的参考品和待测样品均为本公司生产的抗PD-1单克隆抗体，利用XH001培养基稀 释为0、5、10、25、50、150、250、500、1000、2000ng/mL的浓度梯度；XH001培养基购 买自北京陆桥技术股份有限公司
[0023](3)读板：加入100μL/孔的2
×
读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；
[0024](4)数据处理：用抗PD-1单克隆抗体的浓度为横坐标，ECL信号为纵坐标，分别对参 考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50值，计算得到待测样品的生物学 活性。
[0025]本专利技术另一方面提供了上述的生物活性测定方法在抗PD-1单克隆抗体的质控中的应用。
[0026]本专利技术所述的PD-1包括但不限于下述专利申请：201610656318.4。
[0027]本专利技术的有益效果：
160ng/mL、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体1.2μg/mL，以及系列梯度浓度的参考品和待 测样品(2复孔)，室温中避光孵育1-1.5h；
[0046]所述的参考品和待测样品均为本公司生产的抗PD-1单克隆抗体，利用XH001培养基稀 释为0、5、10、25、50、150、250、500、1000、2000ng/mL的浓度梯度；
[0047](3)读板：加入100μL/孔的2
×
读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；
[0048](4)数据处理：用抗PD-1单克隆抗体的浓度为横坐标，ECL信号为纵坐标，分别对参 考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50值，计算得到待测样品的生物学 活性。
[0049]检测结果如图2所示，待测样品的生物学活性为91％，相关系数R2范围是0.961-0.983， R2>0.95，该方法符合一般生物制品活性检测要求，说明本法对抗PD-1单克隆抗体生物活性 的检测是可行的。
[0050]实施例3
[0051]一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法包括以下步骤：
[0052](1)封闭、洗板：用封闭液将96孔MSD高结合板封闭2小时，PBS缓冲液洗板；
[0053](2)孵育：接种PD-1/CHO-S细胞，接种密度为5.0
×
104个细胞/孔，加入PD-L1-mFc 140ng/mL、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体1.0μg/mL，以及系列梯度浓度的参考品和待 测样品(2复孔)，室温中避光孵育1.2h；
[0054]所述的参考品和待测样品均为本公司生产的抗PD-1单克隆抗体，利用XH001培养基稀 释为0、5、10、25、50、150、250、500、1000、2000ng/mL的浓度梯度；
[0055](3)读板：加入100μL/孔的2
×
读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；
[0056](4)数据处理：用抗PD-1单克隆抗体的浓度为横坐标，ECL信号为纵坐标，分别对参 考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50值，计算得到待测样品的生物学 活性。
[0057]检测结果如图3所示，待测样品的生物学活性为93％，相关系数R2范围是0.993-0.996， R2>0.95，该方法符合一般生物制品活性检测要求，说明本法对抗PD-1单克隆抗体生物活性 的检测是可行的。
[0058]实施例4
[0059]利用抗PD-1单克隆抗体，对本方法进行方法学验证：
[0060]除下述各项中的特殊说明外，实验材料、方法与实施例3中的操作基本相同。
[0061]4.1专属性
[0062]以不针对PD-1靶点的Remicade(Johnson公司产品)为待测样品，采用上述方法检测其与 PD-1/CHO-S细胞的结合活性。
[0063]检测结果表明，不针对PD-1靶点的单克隆抗体即使在与参考品相同稀释浓度条件下，与 PD-1/CHO-S细胞仍然没有结合，平均ECL信号强度接近于零。由此可见，本专利技术检测方法 能够特异性地进行针对PD-1靶点的单克隆抗体结合活性检测。
[0064]4.2线性和范围
[0065]以抗PD-1单克隆抗体参考品为材料，利用XH001培养基将其稀释成生物学活性分别为 60％，80％，100％，120％和140％作为待测样品，对这5个待测样品采用实施例3的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：(1)封闭、洗板：用封闭液将96孔MSD高结合板封闭1-3小时，PBS缓冲液洗板；(2)孵育：依次加入PD-1/CHO-S细胞、PD-L1-mFc、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体，以及系列梯度浓度的参考品和待测样品，室温中避光孵育1-1.5h；所述的参考品和待测样品为抗PD-1单克隆抗体；(3)读板：加入2
×
读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；(4)数据处理：用抗PD-1单克隆抗体的浓度为横坐标，ECL信号为纵坐标，分别对参考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50值，计算得到待测样品的生物学活性。2.根据权利要求1所述的生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱吉安，
申请(专利权)人：朱吉安，
类型：发明
国别省市：