一种快速高效的构建二代测序文库的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种快速高效的构建二代测序文库的试剂盒，包括R1、R2和R3，R1包括DNA片段化末端修复加尾缓冲液、DNA片段化酶和末端修复加尾酶，R2包括连接缓冲液、连接酶和接头，R3包括扩增酶、USER酶、通用引物和index引物。该试剂盒采用序列非特异性的核酸酶，可以在DNA上随机打断；在片段化、末端修复和加尾中添加非离子型去污剂做为增强剂，促进加尾酶的活性，使更多的末端修复片段加上A碱基，提高了片段的利用率；接头使用U型接头，减少了接头二聚体的产生，使更多的接头用于连接DNA片段，提高了文库的转化率。了文库的转化率。了文库的转化率。

【技术实现步骤摘要】
MgCl2、1-10mM DTT、20-100μM dNTP、0.2-1.0mM dATP、20-80mM NaCl、0.1-1mg/ml BSA、体积比0.1％-0.5％TritonX-100，体积比0.1％-1％Enhance。
[0013]上述任一方案中优选的是，所述Enhance可以是Twen20、NP40其中的一种或两种的组合。
[0014]上述任一方案中优选的是，所述DNA片段化酶是非特异性核酸酶和T7 Endonuclease I，所述非特异性核酸酶为嗜盐弧菌Vvn(Vibrio Vulnificus)核酸酶。
[0015]上述任一方案中优选的是，所述末端修复加尾酶为T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow酶几种酶的组合。
[0016]上述任一方案中优选的是，所述接头为U字形接头，且接头的序列如SEQ ID NO.1所示：
[0017]SEQ ID NO.1：5
’-
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3
’
；
[0018]其中，第一位G碱基进行磷酸化修饰，3
′
端最后两个核苷酸之间的连接键进行硫代磷酸化修饰，U碱基为dUTP。
[0019]本专利技术的技术效果和优点：1、DNA片段化酶使用了Vvn核酸酶，这是一种序列非特异性的核酸酶，可以在DNA上随机产生切口，不具有碱基偏好性；
[0020]2、在DNA片段化、末端修复和加A尾中，添加了Enhance，可以促进taq酶的加尾活性，使得更多的末端修复片段加上A碱基，从而使更多的加A片段连上接头，提高了片段的利用率；
[0021]3、接头使用U型接头，减少了接头二聚体的产生，使更多的接头用于连接DNA片段，提高了文库的转化率。
附图说明
[0022]图1为本专利技术中的传统二代测序建库流程；
[0023]图2为利用本专利技术的试剂盒采取的二代测序建库流程；
[0024]图3为试验例1构建的文库2100图；
[0025]图4为试验例2构建的文库2100图。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0028]针对
技术介绍
提到的有些试剂盒的建库转化率低，尤其是对微量样本，这会造成样本很大的损失。针对微量样本，建议用酶切片段化的方法，以减少样本的损失。
[0029]市面上报道可用于核酸打断的片段化酶有很多，应用于高通量测序的片段化酶有
DNase I、Endonuclease V、Tn5转座酶、限制性内切酶等。
[0030]DNaseⅠ在不同的离子存在下可以片段化dsDNA，如在镁离子存在条件下，DNase I随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNaseI可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。然而，实际操作中却易受到多种条件的影响，如酶的用量，反应温度，底物DNA的纯度等。此外研究发现DNaseⅠ对嘧啶核苷酸旁边位点有偏好性，大大影响终文库的多样性。Endonuclease V一般识别特定的位点，随机引入尿嘧啶可用于DNA的随机片段化。由于碱基序列组成的差异，样本的GC含量对Endonuclease V片段化效果有潜在影响，实际操作中尤其是NGS应用中也会受到诸多条件的限制。Tn5转座酶也可以切割DNA，但是由于其片段化的偏好性经常受到业界的诟病。据统计Tn5在插入位点两侧9个碱基左右有明显的偏好性。还有些公司使用几种限制性内切酶的组合，虽然增加限制性内切酶的个数，可以在一定程度上缓解偏好性，但是限制性内切酶始终是存在对序列的偏好性。
[0031]本专利技术打断DNA采用的是序列非特异性核酸酶——Vvn核酸酶和T7 Endonuclease I的组合。Vvn核酸酶可以在DNA上随机产生切刻，进而T7 Endonuclease I识别这个缺刻并在互补链上切割，从而产生DNA双链断裂。只需要改变酶切时间就可以将DNA酶切至特定大小的DNA片段，与初始的Input DNA量以及Input DNA长度无关。
[0032]本专利技术所用的DNA片段化酶所用的DNA可以是各种原核真核微生物基因组、动植物基因组以及人和小鼠基因组等，也可以是cDNA，但是需要保证DNA是溶于无二价阳离子的溶剂中，不溶于二价阳离子的溶剂，如果溶于二价阳离子的溶剂中，需要事先对其进行纯化。因为二价阳离子会抑制片段化酶的活性。
[0033]本专利技术为了进一步提高片段的利用率，在加尾时，添加了非离子型去污剂做为taq酶的增强剂，促进taq酶的活性，使得更多的末端修复片段加上A碱基，从而使更多的加A片段连上接头，促进了片段的利用率。
[0034]为了进一步提高文库的转化率，本专利技术在接头连接步骤中，使用的是U字型的接头。这种类型的接头其一端是封闭的，可以减少接头间的反应，从而可以减少接头二聚体的产生，使更多的接头被有效的利用，进而使更多的连上接头的有效片段被测序。
[0035]实施例一：
[0036]一种快速高效的构建二代测序文库的试剂盒，包括R1、R2和R3；
[0037]所述R1包括DNA片段化末端修复加尾缓冲液、DNA片段化酶和末端修复加尾酶；
[0038]所述R2包括连接缓冲液、连接酶和接头；
[0039]所述R3包括扩增酶、USER酶、通用引物和index引物。
[0040]DNA片段化末端修复加尾缓冲液包括10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT、20μM dNTP、0.2mM dATP、20mM NaCl、0.1mg/ml BSA、体积比0.1％TritonX-100，体积比0.1％Twen20。
[0041]所述DNA片段化酶是非特异性核酸酶和T7 Endonuclease I，其中非特异性核酸酶为Vvn核酸酶。
[0042]所述末端修复加尾酶为T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow酶几种酶的组合。
[0043]所述接头为U字形接头，且接头的序列如SEQ ID NO.1所示：
[0044]5’-
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3
’
；
[0045]其中，第一位G碱基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速高效的构建二代测序文库的试剂盒，其特征在于：包括R1、R2和R3；所述R1包括DNA片段化末端修复加尾缓冲液、DNA片段化酶和末端修复加尾酶；所述R2包括连接缓冲液、连接酶和接头；所述R3包括扩增酶、USER酶、通用引物和index引物。2.根据权利要求1所述的一种快速高效的构建二代测序文库的试剂盒，其特征在于：所述DNA片段化末端修复加尾缓冲液包括10-50mM Tris-HCl、10-50mM MgCl2、1-10mM DTT、20-100μM dNTP、0.2-1.0mM dATP、20-80mM NaCl、0.1-1mg/ml BSA、体积比0.1％-0.5％TritonX-100，体积比0.1％-1％Enhance。3.根据权利要求1所述的一种快速高效的构建二代测序文库的试剂盒，其特征在于：所述Enhance为Twen20、NP40其中的一种或两种的组合。4.根据权利要求1所述的一种快速高效的构建二...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾志鹏，张鹏，邢宽，谢珍，何志健，何贵伦，安雪茹，
申请(专利权)人：南京实践医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：