一种牡蛎多糖促进泌乳作用研究方法技术

本发明专利技术公开了一种牡蛎多糖促进泌乳作用研究方法，包括以下步骤：S1、实验材料（1）牡蛎、母鼠60只和公鼠30只，体重220‑250g；（2）甲磺酸溴隐亭片，2.5mg/片；S2、主要实验试剂，无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、葡萄糖、十水合四硼酸钠、碘、碘化钾、刚果红、溴化钾、三氟乙酸、三氯甲烷、正丁醇、重蒸酚、葡萄糖、硫酸钾。该牡蛎多糖促进泌乳作用研究方法，通过此次研究发现牡蛎多糖能够改善缺乳母鼠的泌乳能力，使其泌乳量恢复到接近正产水平，也表明所选的多糖剂量正确，此次研究将为牡蛎多糖以后研发产后缺乳药物及高品质的营养品积累资料，奠定理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一种牡蛎多糖促进泌乳作用研究方法
本专利技术涉及牡蛎多糖促进泌乳作用
，具体为一种牡蛎多糖促进泌乳作用研究方法。
技术介绍
由于母乳中富含婴儿发育过程中必须的抗体分子及免疫因子，易于消化吸收，是婴儿成长发育过程中最好的营养来源，因此母乳喂养的大众关注度不断上升，据国内外研究显示，46％的婴儿因产妇产后缺乳而得不到足够的乳汁喂养，导致产后缺乳的原因有很多，如营养缺乏、激素水平不足、情绪紧张或不良的生活方式等。中医学认为，乳汁的多少与母体的脏腑气血有紧密联系，因此研发治疗产妇缺乳药物及高级营养品对改善产妇缺乳状况具有重要意义。牡蛎多糖抗氧化、降血脂、促生精等丰富的生物活性给予了本次研究较大的意义，通过查阅国内外文献后，发现有关于牡蛎多糖是否促进泌乳作用方面的研究基本没有，因此牡蛎多糖促进泌乳作用研究对于丰富牡蛎多糖的生物活性内容具有一定意义。本研究的目的是为了初步探讨牡蛎多糖是否能够改善缺乳大鼠的泌乳功能，评价牡蛎糖原是否能提高产后缺乳母鼠血清催乳素水平、泌乳量、仔鼠体增重及器官指数等，并观察比较各组乳腺组织的形态学变化。为牡蛎多糖研发相关药物及高品质的营养品积累资料，奠定理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牡蛎多糖促进泌乳作用研究方法，以解决上述
技术介绍
中提出的是为了初步探讨牡蛎多糖是否能够改善缺乳大鼠的泌乳功能，评价牡蛎糖原是否能提高产后缺乳母鼠血清催乳素水平、泌乳量、仔鼠体增重及器官指数等，并观察比较各组乳腺组织的形态学变化的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种牡蛎多糖促进泌乳作用研究方法，包括以下步骤：S1、实验材料(1)牡蛎、母鼠60只和公鼠30只，体重220-250g；(2)甲磺酸溴隐亭片，2.5mg/片。S2、主要实验试剂无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、葡萄糖、十水合四硼酸钠、碘、碘化钾、刚果红、溴化钾、三氟乙酸、三氯甲烷、正丁醇、重蒸酚、葡萄糖、硫酸钾、三氯乙酸、氯化钡、明胶、氢氧化钠、氯化钠、D-葡萄糖醛酸、二甲苯、苏木精伊红染色剂、水合氯醛、咔唑、亚铁氰化钾、乙酸锌、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶。S2、动物实验方法(1)采用酶解法提取牡蛎粗多糖(2)大鼠分组方法大鼠按雌雄比例为2:1同笼饲养，合笼三天，将出现阴栓的母鼠用标记笔在其尾巴末端做上标记，挑选出怀孕雌鼠，并将雌鼠单笼饲养，母鼠妊娠结束后，在产仔后的母鼠中挑选出时间相差较短(24h左右)的24只母鼠作为实验对象，并将每窝仔鼠数均调整到12只，最后将挑选出的24只母鼠以每组8只随机分为3组，分别为正常组、模型组和牡蛎多糖组。于产后第二天，第一组母鼠作为正常组仅灌胃蒸馏水，第二组母鼠作为模型组仅灌胃溴隐亭溶液(0.45mg/ml)，第三组治疗试验组同时给予溴隐亭溶液和牡蛎多糖溶液(500mg/kg)。(3)仔鼠称重(4)利用SPSS19.0软件对数据进行单因素方差分析(5)采集和保存血清(6)乳腺的采集(7)PRL浓度的检测(8)标准曲线及浓度计算利用Excel制作标准曲线后，将样品所测OD值代入下图直线回归方程式中，计算出样品浓度后，再乘以稀释倍数，即可得到样品的实际浓度。(9)乳腺指数及脏器指数的计算(10)乳腺组织观察a、将固定48h后的乳腺组织取出，修整其形状后，用流水清洗固定液。b、将经过自来水冲洗除去固定液的组织块置于不同梯度浓度的酒精中，按照如下步骤逐渐从低浓度到高浓度酒精进行脱水。50％乙醇30min--75％乙醇30min--80％乙醇30min--95％乙醇30min无水乙醇Ⅰ30min--无水乙醇Ⅱ40minc、将完全脱水后的组织按顺序分别置于二甲苯：酒精(1:1)、二甲苯Ⅰ各15min，二甲苯Ⅱ40min。d、石蜡融化后，将透明后的组织按如下步骤浸蜡，浸蜡温度为60℃(温度低可再高些)石蜡Ⅰ1h--石蜡Ⅱ1h--石蜡Ⅲ1h(11)制作组织切片a、切片蜡块固定在支持器上，蜡块与刀片形成5°夹角，将蜡块切片，蜡块切片内组织切面要完整光滑，再将刀片向左移动约一个蜡块宽度的距离，调节切片厚度为5μm，再进行切片，切片连续呈带状，完整均匀。b、展片预先将烘片机46℃预热，在洁净的载玻片上滴加少量蛋清，同方向抹匀，然后滴加几滴蒸馏水，再将蜡片小心夹取到载玻片上，最后将载玻片置于烘片机上烘干。c、组织切片的脱蜡和水化完全烘干的组织切片置于玻片架上，按如下步骤脱蜡：二甲苯Ⅰ：5min。二甲苯Ⅱ：5min。1/2二甲苯+1/2无水乙醇溶液：5min。脱蜡完成后，将组织切片按如下步骤洗脱二甲苯：无水乙醇：2min。95％乙醇：2min。90％乙醇：2min。80％乙醇：2min。70％乙醇：2min。蒸馏水浸洗：2min。将脱蜡后的组织切片依次放入梯度浓度的酒精中，按照无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇的顺序脱去二甲苯，每个浓度的乙醇浸泡2min，最后用蒸馏水浸洗2min。d、组织切片的苏木素染色首先将组织切片上的蒸馏水甩干，然后将组织切片浸泡在苏木素染液中染色4min，最后蒸馏水浸洗2min，在低倍显微镜下观察染色结果，若细胞核染色不清晰，重复之前步骤，直至染色清晰。e、组织切片的伊红染色将苏木素染色完成后的组织切片按如下步骤脱色：70％乙醇：2min。80％乙醇：2min。95％乙醇：20min。100％乙醇Ⅰ：2min。脱色完成后，将组织切片置于95％乙醇和0.5％伊红染液混合溶液中浸泡染色12min，再按如下步骤洗脱。95％乙醇：2min。无水乙醇Ⅰ：2min。无水乙醇Ⅱ：2min。1/2二甲苯+1/2乙醇：2min。二甲苯Ⅰ：10min。二甲苯Ⅱ：10min。f、组织切片的封片将染色后的载玻片从二甲苯中取出，在其表面液体未干的情况下立即滴加中性树胶盖上盖玻片进行封片。S3、分析多糖的实验方法(1)多糖含量测定-苯酚硫酸法(2)糖醛酸含量测定-咔唑比色法(3)硫酸基含量测定-氯化钡-明胶法(4)紫外全波长扫描比较纯化分离效果将双光束紫外可见光光度计波长范围调至200nm-800nm，取浓度为1mg/ml的牡蛎粗多糖溶液在此波长范围内进行扫描，以X轴为波长变化，Y轴为吸光值，制作紫外扫描图。由于蛋白质与核酸分别在280nm和260nm下有最大吸收峰，所以通过紫外扫描所得的吸光值变化即可判断sevage除蛋白前后牡蛎粗多糖中是否含有蛋白质和核酸两种杂质。S4、多糖结构测定方法(1)如果多糖中含有多股螺旋构象，则刚果红将与其发生络合作用，使溶液的最大吸收波长增加。将N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牡蛎多糖促进泌乳作用研究方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1、实验材料/n（1）牡蛎、母鼠60只和公鼠30只，体重220-250g；/n（2）甲磺酸溴隐亭片，2.5mg/片。/nS2、主要实验试剂/n无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、葡萄糖、十水合四硼酸钠、碘、碘化钾、刚果红、溴化钾、三氟乙酸、三氯甲烷、正丁醇、重蒸酚、葡萄糖、硫酸钾、三氯乙酸、氯化钡、明胶、氢氧化钠、氯化钠、D-葡萄糖醛酸、二甲苯、苏木精伊红染色剂、水合氯醛、咔唑、亚铁氰化钾、乙酸锌、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶。/nS2、动物实验方法/n（1）采用酶解法提取牡蛎粗多糖/n（2）大鼠分组方法/n大鼠按雌雄比例为2:1同笼饲养，合笼三天，将出现阴栓的母鼠用标记笔在其尾巴末端做上标记，挑选出怀孕雌鼠，并将雌鼠单笼饲养，母鼠妊娠结束后，在产仔后的母鼠中挑选出时间相差较短（24h左右）的24只母鼠作为实验对象，并将每窝仔鼠数均调整到12只，最后将挑选出的24只母鼠以每组8只随机分为3组，分别为正常组、模型组和牡蛎多糖组。/n于产后第二天，第一组母鼠作为正常组仅灌胃蒸馏水，第二组母鼠作为模型组仅灌胃溴隐亭溶液（0.45mg/ml），第三组治疗试验组同时给予溴隐亭溶液和牡蛎多糖溶液（500mg/kg）。/n（3）仔鼠称重/n（4）利用SPSS19.0软件对数据进行单因素方差分析/n（5）采集和保存血清/n（6）乳腺的采集/n（7）PRL浓度的检测/n（8）标准曲线及浓度计算/n利用Excel制作标准曲线后，将样品所测OD值代入下图直线回归方程式中，计算出样品浓度后，再乘以稀释倍数，即可得到样品的实际浓度。/n（9）乳腺指数及脏器指数的计算/n（10）乳腺组织观察/na、将固定48h后的乳腺组织取出，修整其形状后，用流水清洗固定液。/nb、将经过自来水冲洗除去固定液的组织块置于不同梯度浓度的酒精中，按照如下步骤逐渐从低浓度到高浓度酒精进行脱水。/n50%乙醇30min--75%乙醇30min--80%乙醇30min--95%乙醇30min/n无水乙醇Ⅰ30min--无水乙醇Ⅱ40min/nc、将完全脱水后的组织按顺序分别置于二甲苯：酒精（1:1）、二甲苯Ⅰ各15min，二甲苯Ⅱ40min。/nd、石蜡融化后，将透明后的组织按如下步骤浸蜡，浸蜡温度为60℃（温度低可再高些）/n石蜡Ⅰ1h--石蜡Ⅱ1h--石蜡Ⅲ1h/n（11）制作组织切片/na、切片/n蜡块固定在支持器上，蜡块与刀片形成5°夹角，将蜡块切片，蜡块切片内组织切面要完整光滑，再将刀片向左移动约一个蜡块宽度的距离，调节切片厚度为5μm，再进行切片，切片连续呈带状，完整均匀。/nb、展片/n预先将烘片机46℃预热，在洁净的载玻片上滴加少量蛋清，同方向抹匀，然后滴加几滴蒸馏水，再将蜡片小心夹取到载玻片上，最后将载玻片置于烘片机上烘干。/nc、组织切片的脱蜡和水化/n完全烘干的组织切片置于玻片架上，按如下步骤脱蜡：/n二甲苯Ⅰ：5min。/n二甲苯Ⅱ：5min。/n1/2二甲苯+1/2无水乙醇溶液：5min。/n脱蜡完成后，将组织切片按如下步骤洗脱二甲苯：/n无水乙醇：2min。/n95%乙醇：2min。/n90%乙醇：2min。/n80%乙醇：2min。/n70%乙醇：2min。/n蒸馏水浸洗：2min。/n将脱蜡后的组织切片依次放入梯度浓度的酒精中，按照无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇的顺序脱去二甲苯，每个浓度的乙醇浸泡2min，最后用蒸馏水浸洗2min。/nd、组织切片的苏木素染色/n首先将组织切片上的蒸馏水甩干，然后将组织切片浸泡在苏木素染液中染色4min，最后蒸馏水浸洗2min，在低倍显微镜下观察染色结果，若细胞核染色不清晰，重复之前步骤，直至染色清晰。/ne、组织切片的伊红染色/n将苏木素染色完成后的组织切片按如下步骤脱色：/n70%乙醇：2min。/n80%乙醇：2min。/n95%乙醇：20min。/n100%乙醇Ⅰ：2min。/n脱色完成后，将组织切片置于95%乙醇和0.5%伊红染液混合溶液中浸泡染色12min，再按如下步骤洗脱。/n95%乙醇：2min。/n无水乙醇Ⅰ：2min。/n无水乙醇Ⅱ：2min。/n1/2二甲苯+1/2乙醇：2min。/n二甲苯Ⅰ：10min。/n二甲苯Ⅱ：10min。/nf、组织切片的封片/n将染色后的载玻片从二甲苯中取出，在其表面液体未干的情况下立即滴加中性树胶盖上盖玻片进行封片。/nS3、分析多糖的实验方法/n（1）多糖含量测定-苯酚硫酸法/n（2）糖醛酸含量测定-咔唑比色法/n（3）硫酸基含量测定-氯化钡-明胶法/n（4）紫外全波长扫描比较纯化分离效果/n将双光束紫外可见光光度计波长范围调至200nm-800nm，取浓度为1mg/ml的牡蛎粗多糖...

【技术特征摘要】
1.一种牡蛎多糖促进泌乳作用研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、实验材料
（1）牡蛎、母鼠60只和公鼠30只，体重220-250g；
（2）甲磺酸溴隐亭片，2.5mg/片。
S2、主要实验试剂
无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、葡萄糖、十水合四硼酸钠、碘、碘化钾、刚果红、溴化钾、三氟乙酸、三氯甲烷、正丁醇、重蒸酚、葡萄糖、硫酸钾、三氯乙酸、氯化钡、明胶、氢氧化钠、氯化钠、D-葡萄糖醛酸、二甲苯、苏木精伊红染色剂、水合氯醛、咔唑、亚铁氰化钾、乙酸锌、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶。
S2、动物实验方法
（1）采用酶解法提取牡蛎粗多糖
（2）大鼠分组方法
大鼠按雌雄比例为2:1同笼饲养，合笼三天，将出现阴栓的母鼠用标记笔在其尾巴末端做上标记，挑选出怀孕雌鼠，并将雌鼠单笼饲养，母鼠妊娠结束后，在产仔后的母鼠中挑选出时间相差较短（24h左右）的24只母鼠作为实验对象，并将每窝仔鼠数均调整到12只，最后将挑选出的24只母鼠以每组8只随机分为3组，分别为正常组、模型组和牡蛎多糖组。
于产后第二天，第一组母鼠作为正常组仅灌胃蒸馏水，第二组母鼠作为模型组仅灌胃溴隐亭溶液（0.45mg/ml），第三组治疗试验组同时给予溴隐亭溶液和牡蛎多糖溶液（500mg/kg）。
（3）仔鼠称重
（4）利用SPSS19.0软件对数据进行单因素方差分析
（5）采集和保存血清
（6）乳腺的采集
（7）PRL浓度的检测
（8）标准曲线及浓度计算
利用Excel制作标准曲线后，将样品所测OD值代入下图直线回归方程式中，计算出样品浓度后，再乘以稀释倍数，即可得到样品的实际浓度。
（9）乳腺指数及脏器指数的计算
（10）乳腺组织观察
a、将固定48h后的乳腺组织取出，修整其形状后，用流水清洗固定液。
b、将经过自来水冲洗除去固定液的组织块置于不同梯度浓度的酒精中，按照如下步骤逐渐从低浓度到高浓度酒精进行脱水。
50%乙醇30min--75%乙醇30min--80%乙醇30min--95%乙醇30min
无水乙醇Ⅰ30min--无水乙醇Ⅱ40min
c、将完全脱水后的组织按顺序分别置于二甲苯：酒精（1:1）、二甲苯Ⅰ各15min，二甲苯Ⅱ40min。
d、石蜡融化后，将透明后的组织按如下步骤浸蜡，浸蜡温度为60℃（温度低可再高些）
石蜡Ⅰ1h--石蜡Ⅱ1h--石蜡Ⅲ1h
（11）制作组织切片
a、切片
蜡块固定在支持器上，蜡块与刀片形成5°夹角，将蜡块切片，蜡块切片内组织切面要完整光滑，再将刀片向左移动约一个蜡块宽度的距离，调节切片厚度为5μm，再进行切片，切片连续呈带状，完整均匀。
b、展片
预先将烘片机46℃预热，在洁净的载玻片上滴加少量蛋清，同方向抹匀，然后滴加几滴蒸馏水，再将蜡片小心夹取到载玻片上，最后将载玻片置于烘片机上烘干。
c、组织切片的脱蜡和水化
完全烘干的组织切片置于玻片架上，按如下步骤脱蜡：
二甲苯Ⅰ：5min。
二甲苯Ⅱ：5min。
1/2二甲苯+1/2无水乙醇溶液：5min。
脱蜡完成后，将组织切片按如下步骤洗脱二甲苯：
无水乙醇：2min。
95%乙醇：2min。
90%乙醇：2min。
80%乙醇：2min。
70%乙醇：2min。
蒸馏水浸洗：2min。
将脱蜡后的组织切片依次放入梯度浓度的酒精中，按照无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦小明，谌素华，章超桦，曹文红，郑惠娜，林海生，高加龙，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东;44