用于多囊卵巢综合征诊断的生物标志物和试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术提供了一组可用于检测多囊卵巢综合征不同代谢亚型的生物标志物，并进一步提供包含该等生物标志物的用于检测多囊卵巢综合征的试剂盒及其使用方法，可用于对多囊卵巢综合征的快速高效诊断。

【技术实现步骤摘要】
用于多囊卵巢综合征诊断的生物标志物和试剂盒及使用方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及多囊卵巢综合征诊断检测用的生物标志物和试剂盒领域。
技术介绍
生育力下降成为严重的社会问题，全球的不孕不育率达到10%-15%，生殖内分泌紊乱是目前导致女性不孕的首位病因。多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome，PCOS)是育龄妇女常见的内分泌系统疾病，是无排卵性不孕症的最常见原因之一。该疾病最常见的临床表现是女性出现高雄激素血症，导致月经紊乱、稀少、闭经或不规则阴道出血、不孕、肥胖、多毛、子宫内膜过度增生及恶性变化、以及双侧或单侧卵巢呈多囊性改变并多伴有肥胖表型；在糖脂内分泌代谢方面出现胰岛素抵抗，继而引发糖尿病等并发症，远期并发症还包括、心血管疾病、子宫内膜癌等。传统的多囊卵巢综合征诊断主要依靠月经情况、雄激素水平检测和卵巢B超检测。根据鹿特丹ESHRE/ASRM(2003)标准，须满足下述三项中的两项：月经稀发；临床或者生化雄激素过多症；双侧或单侧卵巢多囊样改变和/或体积增大。但上述方法诊断出的PCOS具有高度异质性，未能引入代谢异常的程度这一重要临床特征对PCOS患者进行亚群的分型。以上问题使得PCOS的诊断与治疗已经成为妇科和内分泌领域共同关注的热点和难点问题。因此，找到一种易于检测的无创性生物标记物诊断方法，结合现有的临床指标，增加代谢特征的指标，来预测和诊断多囊卵巢综合征，对于多囊卵巢综合征的疾病风险评估有很大的意义。目前，市场上还没有针对多囊卵巢综合征的快速高效诊断试剂盒问世，影响到多囊卵巢综合征早期发现及治疗。肠道微生态主要包括肠道细菌、真菌、病毒以及代谢产物，近期研究证实，人体微生态与多囊卵巢综合征的发生发展密切相关，肠道细菌可以转化胆汁酸影响宿主天然免疫系统，进而调节胰岛素抵抗，影响多囊卵巢综合征的发生发展。因此，胆汁酸在体内的丰度变化有望多囊卵巢综合征的表征或诊断提供新的路径。
技术实现思路
本专利技术提供一组可用于检测多囊卵巢综合征不同代谢亚型的生物标志物，进一步提供包含该等生物标志物的用于检测多囊卵巢综合征的试剂盒及其使用方法。本专利技术的一个方面，提供了一组可用于多囊卵巢综合征诊断的生物标志物，所述生物标志物包括多种代谢物，所述的代谢物选自胆汁中的胆酸组分，其在至少一种靶血浆或血清中与在一种对照血浆或血清中差异表达。所述生物标志物可任选地与临床指标结合用于受试体多囊卵巢综合征。在一种实施方案中，本专利技术生物标志物指受试体生物样本中存在的代谢物成分，受试体可以是人类或哺乳动物。生物样本可选自来源于受试体的血浆或血清。优选的，所述生物样本为血清。在一种实施方案中，所述代谢物选自下列代谢物中一种或多种：胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺胆酸、7-酮胆酸、牛磺熊去氧胆酸。优选的，所述代谢物为胆酸、甘氨去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸。在一种实施方案中，所述的临床指标组合包含至少一个临床指标，其在至少一个多囊卵巢综合征患者中与在一个健康者中差异表达。临床指标可以按照常规临床检测方法获得，例如卵泡刺激素（FSH），黄体生成素(LH)，黄体生成素/卵泡刺激素比值，性激素结合球蛋白（SHBG），脱氢表雄酮（DHEA），雌二醇（E2），睾酮（T）,雄烯二酮（AND），游离雄激素指数（FAI），空腹血糖，空腹胰岛素，窦卵泡数，多毛评分等。在一种实施方案中，所述的生物标志物用于制备测试受试体多囊卵巢综合征的试剂盒的用途，所述试剂盒的使用方法包括，可通过测试受试体血浆或血清中代谢物的水平，任选地结合临床指标，测试受试体多囊卵巢综合征，所述临床指标优选受试体多毛评分，游离雄激素指数，空腹胰岛素。本专利技术的另一方面，提供包含胆酸、甘氨去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸三种代谢物的可用于多囊卵巢综合征诊断试剂盒，所述试剂盒包含胆酸、甘氨去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸的标准溶液和内标标准溶液，所述内标标准溶液指同位素标记的胆酸、甘氨去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸，同位素标记方式可以是2H或13C。在一种实施方案中，所述试剂盒还包含萃取液，萃取液由甲醇和乙腈组成，甲醇和乙腈的体积比为：1：1-5：1。进一步地，所述试剂盒还包含700μL的96孔板、350μL的V型96孔板、封板硅胶、96孔密封铝膜。本专利技术的另一方面，提供上述试剂盒用于诊断多囊卵巢综合征的使用方法，具体为，通过测定受试体的血清或血浆中代谢物胆酸、甘氨去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸的水平，并将这些测定值输入随机森林模型得到分值截断值进行判定。在一种实施方案中，上述试剂盒用于诊断多囊卵巢综合征的使用方法，包括下列步骤：a)配制不同浓度的代谢产物标准品溶液：分别以胆酸、甘氨去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸的标准溶液配制不同浓度的溶液，与空白对照一起置于离心管，于台式离心机4000-10000转下离心10-30分钟；向各离心管加入新鲜制备的去离子水200微升，剧烈振荡，在800-1200转/分钟振荡溶解10-15分钟，静置，备用；b)内标标准品溶液配制：取3毫升的甲醇作内标稀释液，加入到内标准品溶液中，盖上盖子，剧烈振荡，静置约15分钟溶解。稀释内标溶液，内标溶液加到96孔微孔板；c)血清或血浆样本的制备：取出试剂盒提供的700微升微孔板，在A1到A8孔中依次加入5微升标准品1到标准品7和空白对照，在其他孔中加入5微升血清(或血浆)样品或5微升低、中、高浓度质控品。在各孔中加入25微升的内标准品溶液，盖上硅胶盖，1000rpm振荡10min。2000g离心2分钟。轻轻取下硅胶盖，避免微孔板中液体溅出，妥善放置硅胶垫防止污染，备用；30℃1450rpm反应60分钟，小心取下硅胶垫，妥善放置硅胶垫防止污染，备用；各孔加入350微升上样缓冲液，盖上硅胶盖剧烈振荡；-20℃放置20分钟，2000g离心20分钟；取下硅胶盖，小心吸取150微升上清至干净的V型底微孔板中，盖上铝箔封套，放入自动进样器中；d)将c)中制得的样本以液相色谱和质谱进行测定，计算样本中代谢产物的浓度；e)将d)中计算得到的生物标志物的浓度输入随机森林模型进行计算，按照分值对受试体的多囊卵巢综合征进行判定。在一种实施方案中，本专利技术应用的随机森林模型可以是市场上可提供的软件，这些软件也可以任选地作为上述试剂盒的一部分。作为优选方案，软件包作为试剂盒的一部分。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1A:临床指标的诊断价值的ROC曲线图;B:胆汁酸组合的诊断价值的ROC曲线图;C:临床+胆酸组合的诊断价值的ROC曲线图;图2胆汁酸组合的诊断价值的ROC曲线图；图3胆汁酸结合临床指标组合的诊断能力的ROC曲线图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例中未注明具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于多囊卵巢综合征诊断的试剂盒，其特征在于，包含生物标志物的标准溶液和内标标准溶液，所述生物标志物包括胆酸、甘氨去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸，并且至少一种生物标志物在受试体生物样本中与对照样本中差异表达；所述受试体生物样本生物样本选自血浆或血清；所述内标标准溶液为经同位素标记的所述生物标志物，同位素标记方式为

【技术特征摘要】
1.一种用于多囊卵巢综合征诊断的试剂盒，其特征在于，包含生物标志物的标准溶液和内标标准溶液，所述生物标志物包括胆酸、甘氨去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸，并且至少一种生物标志物在受试体生物样本中与对照样本中差异表达；所述受试体生物样本生物样本选自血浆或血清；所述内标标准溶液为经同位素标记的所述生物标志物，同位素标记方式为2H或13C标记；所述生物标志物任选地与临床指标结合用于诊断受试体多囊卵巢综合征亚型。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物标志物进一步包括下列代谢物中一种或多种：熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸和牛磺胆酸，所述临床指标选自受试者血浆如下指标中的一种或多种：卵泡刺激素（FSH），黄体生成素(LH)，黄体生成素/卵泡刺激素比值，性激素结合球蛋白（SHBG），脱氢表雄酮（DHEA），雌二醇（E2），睾酮（T）,雄烯二酮（AND），游离雄激素指数（FAI），空腹血糖，空腹胰岛素，窦卵泡数，以及多毛评分。

【专利技术属性】
技术研发人员：乔杰，姜长涛，庞艳莉，汪锴，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11