【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】微生物和精细化学品生产
本专利技术涉及发酵生产精细化学品、尤其衣康酸酯或衣康酸。本专利技术提供生产微生物、发酵组合物和培养基、可用于生所述产物的蛋白质与表达这类蛋白质的核酸,和用于生产精细化学品的方法。专利技术背景衣康酸,也称作亚甲基酸琥珀酸,亚甲基丁二酸、丙烯二羧酸或2-丙烯-1,2-二羧酸,是多种产品(例如丙烯酸纤维和橡胶)的重要前体,或例如用作非织造纤维、纸和混凝土涂料中的粘合剂和施胶剂。衣康酸酯可以用作其他商品和专用化学品的中间体。工业上迄今用来生产衣康酸的主要生产微生物是丝状真菌土曲霉(Aspergillusterreus,土曲霉(A.terreus))。尽管已经在土曲霉中实现高滴度的衣康酸,该生物遭遇最佳用于衣康酸生产的培养基中生长不良并且不利地受剪切应力影响,从而排除在常规的搅拌罐生物反应器中进行发酵。以遗传方式优化土曲霉的尝试至多已经产生不确定的结果(参见例如WO2016069849)。已经测试用于衣康酸生产的多种备选微生物,包括解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)(WO2016069849)、大肠杆菌(Escherichiacoli)(US2010285546)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(WO2015181312)。Geiser等人(FungalBiologyandBiotechnology2014,1:2)已经测试用于衣康酸生产的多种黑粉菌(Ustilaginomycetes)并且发现大部分受测微生物还以甚至更大的量产生副产物,如苹果酸酯, ...
【技术保护点】
1.衣康酸生产宿主微生物,其中微生物包含至少一个在ip基因座外部整合入微生物的基因组中的异源表达盒,其中表达盒包含/na)在有功能启动子的有效控制下的异源RIA1基因,和/或/nb)在异源有功能启动子的有效控制下的RIA1基因。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180607 EP 18176542.11.衣康酸生产宿主微生物,其中微生物包含至少一个在ip基因座外部整合入微生物的基因组中的异源表达盒,其中表达盒包含
a)在有功能启动子的有效控制下的异源RIA1基因,和/或
b)在异源有功能启动子的有效控制下的RIA1基因。
2.衣康酸生产宿主微生物,其中宿主是包含表达盒的重组微生物,所述表达盒用于
-表达RIA1基因和/或
-表达至少两个选自ADI1、MTT1和TAD1的基因,
其中所述表达盒在整合位点处整合入微生物的基因组中,其中整合位点
a)位于左边界基因和右边界基因之间,其中在相应野生型微生物中,左边界基因和右边界基因的相应翻译起始密码子的相应第一核苷酸由最多51600个核苷酸分隔,
其中左边界基因编码具有乙酰-CoA合成酶活性的蛋白质,并且
其中右边界基因编码蛋白质,其由与SEQIDNO.25具有至少21%同一性的氨基酸序列组成;和/或
b)距可读框的最近边界至多51600个核苷酸存在,所述可读框翻译成与SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25中任一者具有至少30%序列同一性的氨基酸序列,和/或
c)位于可读框内部或替换可读框,所述可读框翻译成与SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25中任一者具有至少30%序列同一性的氨基酸序列。
3.衣康酸生产宿主微生物,其中宿主是重组微生物,其
a)包含产生衣康酸的活跃衣康酸代谢途径,和
b)其中失活至少一个基因,其
i)编码与以下者具有至少30%序列同一性的蛋白质和/或
ii)其互补链在至少低严格性条件下与编码以下者的核酸序列杂交蛋白质序列SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23或SEQIDNO.25中任一者。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的生产宿主微生物,其中与相同条件下培养的相应野生型菌株相比,
a)RIA1基因的表达水平增加至少50倍,和/或
b)至少两个选自ADI1、MTT1和TAD1的基因的表达水平增加至少1000倍,和/或
c)ITP1基因的表达水平增加最多500倍。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的生产宿主微生物,其中微生物在分类学上属于
黑粉菌纲(Ustilaginomycetes),甚至更优选地属于
黑粉菌目(Ustilaginales),甚至更优选地属于
黑粉菌科(Ustilaginaceae),甚至更优选地属于以下任一属
Anomalomyces、Anthracocystis、Bromeliago、核黑粉菌属(Cintractia)、皮堆黑粉菌属(Dermatosorus)、Dirkmeia、Eriocortex、丝黑粉菌属(Farysia)、皮特黑粉菌属(Franzpetrakia)、Gymnocintractia、Heterotolyposporium、Kalmanozyma、Langdonia、Leucocintractia、Macalpinomyces、瘤黑粉菌属(Melanopsichium)、莫氏黑粉菌属(Moesziomyces)、Moreaua、Mycosyrinx、Parvulago、Pericladium、Portalia、假溢酵母属(Pseudozyma)、Restiosporium、裂孢黑粉菌属(Schizonella)、Shivasia、孢堆黑粉菌属(Sporisorium)、Stegocintractia、亚团黑粉菌属(Tolyposporium)、茎黑粉菌属(Tranzscheliella)、Trichocintractia、Triodiomyces、Tubisorus、黑粉菌属(Ustilago)、Websdanea,并且最优选地属于
假溢酵母属。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的生产宿主微生物,用于将葡萄糖转化成衣...
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