本发明专利技术涉及一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法，属于生物检测领域。该方法采用甲苯磺丁脲为内标，乙腈沉淀蛋白处理后，采用高效液相色谱法‑电喷雾离子化串联质谱法来检测羟基酪醇在Beagle犬血浆样品中的浓度。本发明专利技术方法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药典2015年版以及NMPA2014年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品分析的要求。
【技术实现步骤摘要】
一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法
本专利技术涉及一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法，属于生物检测领域。
技术介绍
羟基酪醇(hydroxytyrosol，HT)，化学名称为3,4-二羟基苯乙醇，是存在于橄榄叶和橄榄油中的天然多酚类成分，具有体外抗氧化作用，常用于保健品和食品添加剂。最近研究表明，羟基酪醇具有抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化、保护心脏等多种有益于人体健康的药理活性，其药用价值亟待开发，对羟基酪醇的成药性研究和临床研究将是未来主要研究方向。而对羟基酪醇成药性评价的临床前研究涉及不同种属实验动物的药代/毒代动力学研究，因此针对各类生物样本建立快速、灵敏、专属性强的羟基酪醇分析检测方法十分必要。目前关于羟基酪醇的体内分析方法较少，针对不同生物基质开发的分析方法也不相同。例如文献1(杨茜.LC-MS/MS法研究羟基酪醇对甲苯磺酸酯药代动力学及组织分布[D],唐山:华北理工大学,2019.)公开了一种测定大鼠血浆及组织中羟基酪醇的LC-MS/MS方法并成功应用于羟基酪醇前体药物大鼠体内药代动力学及组织分布研究；文献2(PieroDelBoccio,AntoniettaDiDeo,AmaliaDeCurtis,etal.Liquidchromatography-tandemmassspectrometryanalysisofoleuropeinanditsmetabolitehydroxytyrosolinratplasmaandurineafteroraladministration[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,2003,785(1):47-56.)公开了LC-MS/MS测定大鼠血浆及尿液中环烯醚萜苷及其生物活性代谢物羟基酪氨酸的定量方法；此外对于人服用橄榄油后血浆中羟基酪醇的含量测定也有相关报道(PastorA,Rodríguez-Morató,Jose,etal.Analysisoffreehydroxytyrosolinhumanplasmafollowingtheadministrationofoliveoil[J].JournalofChromatographyA,2016:183-190.)。而对于Beagle犬血浆中羟基酪醇的含量测定方法尚未见文献报道，由于羟基酪醇极易被氧化，稳定性差，药代动力学研究要求的生物分析方法必须灵敏准确，本专利技术首次建立了利用LC/MS/MS测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的检测方法，为羟基酪醇的临床前研究奠定了坚实的生物分析基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种Beagle犬血浆中羟基酪醇的检测方法。本专利技术的测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法，其包括采用高效液相色谱法-电喷雾离子化串联质谱法即HPLC-MS-MS法来检测Beagle犬血浆中羟基酪醇的浓度。本专利技术所述的测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法，其具体包括如下步骤：(1)血浆样品处理：100μL血浆样品置于1.5mL离心管中，加入10μL甲苯磺丁脲内标溶液及500μL乙腈溶液，涡旋2min，13000rpm(8℃)离心5min，取上清液作为待测液；(2)取上述待测液1μL进行LC-MS/MS分析，其中液相系统条件为：A相为0.1％甲酸+5mM醋酸铵水，B相为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱：0～0.7min2％B，0.7～1.5min2％→90％B，1.6～2.5min2％B；色谱柱为AccucoreaQC18色谱柱(2.1×50mm，2.6μm)；流速：0.5mL/min；柱温：40℃；进样室温度：15℃；进样量：1.0μL；样品检测时间：2.5min。质谱系统条件为：ABSCIEX5500三重四级杆串联质谱系统；离子源：ESI源；负离子模式；气帘气压力：-35psi；碰撞气：-8psi；离子化电压：-5500psi；离子源温度：550℃；喷雾气：-55psi；辅助加热气：-55psi；多重反应监测(MRM)模式。(3)羟基酪醇标准曲线的测定：取Beagle犬空白血浆，加入羟基酪醇标准系列溶液，配制成相当于羟基酪醇浓度为1，2，5，10，50，200，500，1000，2000ng/mL的血浆标准样品，按步骤(1)、步骤(2)所述的测定方法操作，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法(权重为1/x2)进行回归分析，确定羟基酪醇的血浆样品标准曲线及其定量限。(4)羟基酪醇在Beagle犬体内药代动力学试验：采用两周期交叉试验设计。4只Beagle犬，雄性，随机分成2组。禁食12h后，静注组静脉注射给予羟基酪醇溶液，口服组口服给予羟基酪醇胶囊，给药剂量14mg/kg。各组于给药后0.083、0.167、0.333、0.5、1、2、4、6、8和24h自犬前肢静脉取血约1.5mL。采集后置于冰上，并于1h之内离心分离血浆(离心条件：8000rpm，10min，2-8℃)。14天后，两组动物交叉给药，按上述方法取静脉血并制备血浆。收集的血浆按照步骤(1)中的方法预处理并按照步骤(2)中的高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高通量测定方法以及步骤(3)中所获得羟基酪醇标准曲线计算确定不同取样时间的血浆中羟基酪醇的浓度，并利用PhoenixWinNonlin8.1软件确定羟基酪醇的体内药代动力学参数。血浆样品的测定前预处理是保证LC-MS/MS法灵敏度的关键过程。常见的处理方法包括蛋白沉淀法、固相萃取法和液-液萃取法。本方法采用操作相对简单的蛋白沉淀法，采用乙腈作为沉淀溶剂，峰形好且能保证灵敏度。液相条件中流动相由0.1％甲酸+5mM醋酸铵水和含0.1％甲酸的乙腈组成，梯度洗脱，流动相酸化后可保证羟基酪醇出峰稳定；由于羟基酪醇极性较大，采用AccucoreaQC1850mm短柱进行分析，峰型良好，单个样品的分析时间仅为2.5min，有利于大批量样品的快速分析。母离子/子离子离子对的选择是建立本专利技术中检测方法的关键。样品直接以恒定流速由微量注射泵流入质谱仪时，负离子模式一级全扫描可见明显的[M-H]-母离子峰，m/z为152.9，二级碎片离子峰度最大的为m/z为123.0。改变CE和DP的大小可明显影响峰强度，通过优化，确定本方法最优的CE为-20V，DP为-70V。内标的选择对于检测的灵敏度和特异性至关重要，理想的内标应为同位素标记物或结构类似物。申请人在工作开展中发现，甲苯磺丁脲的LC-MS/MS检出条件与羟基酪醇类似，并且预实验发现两者在此条件下出峰时间相近、无相互干扰，峰形均好，因此本方法确定将甲苯磺丁脲作为羟基酪醇Beagle血浆生物样品测定的内标。本专利技术所建立的测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法，在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药典2015年版以及NMPA2014年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品的分析要求。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：/n(1)血浆样品预处理：取血浆样品加入甲苯磺丁脲内标溶液，再加入乙腈溶液沉淀蛋白，涡旋离心后取上清液；/n(2)采用高效液相色谱法-电喷雾离子化串联质谱(LC-MS/MS)法检测羟基酪醇在Beagle犬血浆中的浓度：所用的液相系统条件为：流动相为0.1％甲酸+5mM醋酸铵水和含0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱；质谱系统采用ESI源，负离子扫描模式；/n该方法可对Beagle犬血浆样品中羟基酪醇进行定量检测，定量检测范围为1-2000ng/mL。/n
【技术特征摘要】
1.一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)血浆样品预处理：取血浆样品加入甲苯磺丁脲内标溶液，再加入乙腈溶液沉淀蛋白，涡旋离心后取上清液；
(2)采用高效液相色谱法-电喷雾离子化串联质谱(LC-MS/MS)法检测羟基酪醇在Beagle犬血浆中的浓度：所用的液相系统条件为：流动相为0.1％甲酸+5mM醋酸铵水和含0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱；质谱系统采用ESI源，负离子扫描模式；
该方法可对Beagle犬血浆样品中羟基酪醇进行定量检测，定量检测范围为1-2000ng/mL。
2.如权利要求1所述的一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法，其特征在于步骤(1)具体为：取100μL血浆样品置于1.5mL离心管中，加入10μL甲苯磺丁脲内标溶液及500μL乙腈溶液，涡旋2min，13000rpm(8℃)离心5min，取上清液作为待测液。
3.如权利要求1所述的一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法，其特征在于，LC-MS/MS法中液相系统条件为流动相：A相为0.1％甲酸+5mM醋酸铵水，B相为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱：0～0.7min2％B，0...
【专利技术属性】
技术研发人员：房绍英，孙淑萌，李帅广，程艳玲，郑晓霞，黄艳妮，赵丹，刘纯，吕慧敏，何小华，马玉奎，刘飞，凌沛学，
申请(专利权)人：山东省药学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。