一种柑橘黄龙病快速检测方法技术

本发明专利技术实施例提供一种柑橘黄龙病快速检测方法，包括：提供从待测植物中获得的柑橘黄龙病病菌DNA；其中，所述柑橘黄龙病病菌DNA的浓度为20ng/μl；以所述柑橘黄龙病病菌DNA为模板进行3次PCR扩增，扩增循环数分别为20‑25次、25‑30次和30‑40次；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果；根据扩增结果获得待测植物柑橘黄龙病的发病程度。本发明专利技术方法可为黄龙病等植物病害的检测分级提供定性的判别依据，同时可针对不同感病程度进行有针对性的防治提供准确的评测手段。

【技术实现步骤摘要】
一种柑橘黄龙病快速检测方法
本专利技术涉及一种柑橘黄龙病快速检测方法。
技术介绍
黄龙病是柑橘(包括橘、柑、橙、柚、枳等)生产上危害最严重，强破坏性的毁灭性病害。黄龙病被认为是由一种专生于柑橘韧皮部组织的细菌引起的，其传播途径包括苗木嫁接以及柑橘木虱传播。目前所有已知的柑橘品种及柑橘近缘种都受到黄龙病病菌的侵染。感染病后的植株不仅不能产生经济价值，且易感程度高的品种如脐橙、葡萄柚等会在几年内逐渐衰亡，且目前尚无黄龙病治疗康复的相关报道。因此提供一种快速的黄龙病病菌鉴定分级方法，对于黄龙病的防控和研究具有重要的意义。目前针对黄龙病病菌的诊断方法主要包括田间诊断、血清学方法诊断、电镜检测诊断和PCR检测诊断等手段。受到柑橘寄主植株内黄龙病病原菌浓度低、分布不均匀及样品制备技术等因素的限制，柑橘黄龙病原菌抗体多数均只能与相似的抗原结合，不能广泛应用于不同区域、品种的检测；电镜观察检测的检出率一般在70％左右，存在大量的漏检；目前常规PCR诊断方法在柑橘黄龙病检测上的应用已经实现了快速、准确、定性的要求，被广泛用于黄龙病的实验室诊断。但PCR只能对柑橘属果树是否感染黄龙病病菌进行检测，但无法有效区分感病植株的感病程度。由此提供一种简单、快捷、准确的柑橘黄龙病快速鉴定分级方法对于柑橘黄龙病田间防治、病树早期干预治疗具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术实施例提供一种柑橘黄龙病快速检测方法，可为黄龙病等植物病害的检测分级提供定性的判别依据，同时可针对不同感病程度进行有针对性的防治提供准确的评测手段。一种柑橘黄龙病快速检测方法，包括：提供从待测植物中获得的柑橘黄龙病病菌DNA；其中，所述柑橘黄龙病病菌DNA的浓度为20ng/μl；以所述柑橘黄龙病病菌DNA为模板进行3次PCR扩增，扩增循环数分别为20-25次、25-30次和30-40次；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果；根据扩增结果获得待测植物柑橘黄龙病的发病程度。本文所述的柑橘黄龙病病菌是指韧皮部杆菌(CandidatusLiberibacterspp.)。在一些实施例中，是从待测植物的叶片、茎(枝条)或根中获得柑橘黄龙病病菌DNA。实际操作中可取适量的待测植物的叶片、茎或根，按常规方法提取其中的柑橘黄龙病病菌即可。在一些实施例中，是从待测植物的叶片(例如0.1g)中提取获得柑橘黄龙病病菌。在一些实施例中，待测植物(例如柑橘)感病时间为1年-3年，例如1年、2年或3年。在一些实施例中，采用StarSpin柱式植物DNA提取试剂盒，获得土壤农杆菌DNA。在一些实施例中，所用的特异性扩增引物为：Hlbsf5'→3'TGTAAAGCTCTTTCGCCGGAHlbsr5'→3'CTTGACGTCATCCCCACCTT本专利技术人研究发现，作为模板的柑橘黄龙病病菌DNA，其浓度控制在20ng/μl为佳，这样可以更有利于引物与模板DNA进行结合，提高扩增效率；并且还可以更准确的反应果树携带柑橘黄龙病菌量的多少。若浓度低于20ng/μl，则导致非特异性扩增概率变大。进一步研究发现，PCR扩增时若扩增循环数低于20，则扩增产物产量过低，无法满足进一步分析操作的需要；若扩增循环数高于40，则出现非特异性扩增，得到的结果与原模板DNA比例差别较大，不能真实反应原始的比例关系。在一些较佳的实施例中，以所述柑橘黄龙病病菌DNA为模板进行3次PCR扩增时，扩增循环数分别为20次、25次和30次。其中，若扩增循环数为20次，可通过琼脂糖凝胶电泳出现条带，则待测植物属于严重感病；若扩增循环数为25次，可通过琼脂糖凝胶电泳出现条带，则待测植物属于中等感病；若若扩增循环数为30次，可通过琼脂糖凝胶电泳出现条带，则待测植物属于轻微感病。在一些实施例中，所述柑橘黄龙病快速检测方法包括：(1)取不同感病时间的黄龙病菌叶片，剪取叶中脉0.1g，剪成1mm左右碎片；放入2ml试管中，加入直径为5mm钢珠，放在研磨设备上进行震荡研磨5min，频率30Hz；(2)将研磨好的植物样本用试剂盒进行DNA提取，所选试剂盒为StarSpin柱式植物DNA提取试剂盒，得到50μlDNA样品；(3)用nanodrop仪器进行DNA浓度测量，并用ddH2O(超纯水)将DNA模板配制成浓度为20ng/μl工作液，待用；(4)用已配置的工作液为模板，进行3次PCR扩增反应(聚合酶链式反应)，反应循环数分别为20次、25次和30次；(5)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果；(6)根据扩增结果获得待测植物柑橘黄龙病的发病程度。本专利技术发现聚合酶链式反应循环数与感染柑橘黄龙病植株带菌量之间具有关联性，从而可以对感染柑橘黄龙病植物组织带菌量进行定性检测及感病程度区分。本专利技术方法能够实现对植物组织内带菌含量的精确定量检测分析，可以用于判断植物病情，对病情进行分级，提供一种用于判断病害发病程度的方法，对不同感病程度果树进行分级，为黄龙病病害防治提供一种快速鉴定分级的评价方法。附图说明图1为本专利技术实施例柑橘黄龙病快速检测方法流程示意图。图2为本专利技术实施例柑橘黄龙病快速检测方法中PCR扩增过程。图3本专利技术实施例聚合酶连链式反应(PCR)扩增结果。图4本专利技术对比例聚合酶连链式反应(PCR)扩增结果。图5、图6分别为本专利技术实验例中引物A2/J5，P1/P2，16sf/16sr，Hlbsf/Hlbsr灵敏度分析结果、引物浓度优化电泳结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW，MolecularCloning：aLaboratoryManual，2001)，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。实施例1(1)材料：选取不同感病时间(1年、2年、3年)的黄龙病菌叶片，温室无菌苗作为阴性对照。(2)磨样处理：取叶中脉剪成1mm左右碎片，每份取0.1g，分别放入2ml试管中，加入直径为5mm钢珠，在震荡研磨设备上进行震荡研磨5min，频率30Hz。(3)DNA提取：将研磨好的植物样本用试剂盒进行DNA提取，所选试剂盒为StarSpin柱式植物DNA提取试剂盒，得到50μlDNA样品。(4)DNA模板定量：用仪器nanodrop2.0进行DNA浓度测量，并用ddH2O(超纯水)将DNA模板配制成浓度为20ng/μl工作液，待用。(5)PCR反应：用已配置的DNA模板工作液为扩增模板加入4μl，选取特异性扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柑橘黄龙病快速检测方法，包括：/n提供从待测植物中获得的柑橘黄龙病病菌DNA；其中，所述柑橘黄龙病病菌DNA的浓度为20ng/μl；/n以所述柑橘黄龙病病菌DNA为模板进行3次PCR扩增，扩增循环数分别为20-25次、25-30次和30-40次；/n对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果；/n根据扩增结果获得待测植物柑橘黄龙病的发病程度。/n

【技术特征摘要】
1.一种柑橘黄龙病快速检测方法，包括：
提供从待测植物中获得的柑橘黄龙病病菌DNA；其中，所述柑橘黄龙病病菌DNA的浓度为20ng/μl；
以所述柑橘黄龙病病菌DNA为模板进行3次PCR扩增，扩增循环数分别为20-25次、25-30次和30-40次；
对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果；
根据扩增结果获得待测植物柑橘黄龙病的发病程度。


2.根据权利要求1所述柑橘黄龙病快速检测方法，其中，所述的柑橘黄龙病病菌是指韧皮部杆菌(CandidatusLiberibacterspp.)。


3.根据权利要求1所述柑橘黄龙病快速检测方法，其中，是从待测植物的叶片中提取获得柑橘黄龙病病菌。


4.根据权利要求1所述柑橘黄龙病快速检测方法，其中，所用的特异性扩增引物为：
Hlbsf5'→3'TGTAAAGCTCTTTCGCCGGA
Hlbsr5'→3'CTTGACGTCATCCCCACCTT。


5.根据权利要求1所述柑橘黄龙病快速检测方法，其中，待测植物感病时间为1年-3年，例如1年、2年或3年。


6.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春江，董宏图，张晗，王晓冬，罗斌，王成，侯佩臣，李爱学，
申请(专利权)人：北京农业智能装备技术研究中心，北京农业信息技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11