一种重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法及其联合应用技术

本发明专利技术生物技术研究领域，具体涉及一种重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法及其联合应用。本发明专利技术提供了一种重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法，通过低温诱导来提升重组质粒pET32a‑ChIL‑2和pET28a‑ChIL‑18在大肠杆菌中进行表达，极大的提升了蛋白的生成量，是一种鸡白介素2和白介素18蛋白的高效制备方法。并且本发明专利技术使用纯化的ChIL‑2和ChIL‑18蛋白和表达ChIL‑2和ChIL‑18蛋白的真核质粒与新城疫‑传染性支气管炎二联活疫苗联合免疫SPF雏鸡，可以煎煮增强鸡的IBV抗体滴度，在体液免疫方面能够起到明显的免疫增强作用，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法及其联合应用
本专利技术涉及生物技术研究领域，具体涉及一种重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法及其联合应用。
技术介绍
鸡白介素2和白介素18是重要的细胞因子，主要由Th1细胞及部分B细胞产生。白细胞介素2和白介素18具有广泛的生物学活性，能够促进γ-干扰素(IFN-γ)的产生，刺激淋巴细胞转化，增强NK细胞的杀伤活性，在介导细胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要作用。白细胞介素-2(IL-2)是临床上研究最多的细胞因子，是T细胞在抗原或促有丝分裂原刺激下所分泌的一种淋巴因子。目前，IL-2在抗细菌感染、抗病毒感染、艾滋病的治疗以及作为乙型肝炎病毒免疫佐剂的应用上已取得良好的效果。白细胞介素-18(IL-18)是Okamura等在使用热灭活痤疮丙酸杆菌和脂多糖处理小鼠肝脏时分离纯化克隆得到的分子量约为18～19kDa的物质，由于发现其能诱导T淋巴细胞和NK细胞产生IFN-γ，故将其命名为γ-干扰素诱生因子(IGIF)。鸡白细胞介素-18(ChIL-18)的研究起步相对哺乳动物较晚，直到2000年Schneider等首次克隆到鸡IL-18cDNA，并在大肠杆菌表达系统中成功表达，才开启了对其分子方面的研究。国内刘胜旺等从鸡脾细胞中克隆到长约510bp的鸡IL-18成熟蛋白基因，在大肠杆菌内表达纯化后反复注射豚鼠，得到IL-18多克隆抗体，使得国内对于IL-18的研究进入了分子水平，关于其生物学特性和应用的研究也逐渐成为热点。新城疫(ND)是一种急性高度接触性禽类传染病，自发现以来，已经有四次世界范围内流行，致使养禽业遭受重大经济损失。由于其一年四季均有发生，且近年由ND强毒株引发的非典型新城疫时有发生，耐过鸡群可能长期带毒，常反复发作，成为隐形感染源，严重威胁禽类养殖业，通过疫苗免疫来防范新城疫是目前最常用的方法，但由于各种内外因素，免疫效果不理想甚至出现免疫失败，因而提高新城疫疫苗的免疫效果，从而防止新城疫的发生一直备受关注。传染性支气管炎(IB)是鸡的一种急性、高度传染性的呼吸道疾病，已呈世界性分布，对养鸡业的危害极大。本病常使雏鸡发生严重的呼吸窘迫，并且会导致蛋鸡产蛋量降低。目前我国IB主要发病形式为呼吸困难和肾脏肿胀，即呼吸性和肾型。NIB自1950年在美国发现后，逐渐传播到全球各地，近几年已经成为最广泛流行的IB类型。因此，寻找一种鸡白介素2和白介素18蛋白的高效制备方法，并且探寻鸡白介素2和白介素18的应用方向是目前急需解决的技术问题。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术提供重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法及其联合应用，具体是通过以下技术方案得以实现的：一种重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)SPF鸡脾淋巴细胞的分离及培养；(2)细胞总RNA的提取；(3)RT-PCR扩增ChIL-2和ChIL-18基因；(4)PCR产物的克隆与酶切鉴定；(5)ChIL-2和ChIL-18基因阳性克隆测序分析；(6)重组表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18的构建；(7)重组质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18在大肠杆菌中进行表达。进一步的，所述步骤(1)的SPF鸡脾淋巴细胞的分离及培养，具体是将鸡心脏采血处死，无菌取鸡脾置于冷的Hanks液中，分离掉被膜和脂肪组织后，在200目铜网上研磨，制成单细胞悬液，2000rpm/min离心15min，沉淀细胞悬浮于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，取一离心管，事先加入4ml淋巴细胞分离液，将等体积的细胞悬液缓慢加入到淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，2000rpm/min离心15min，收集淋巴细胞，用RPMI1640培养液离心洗涤2次，计活细胞数量，调整细胞浓度至1×107个/ml，加于6孔细胞培养板，每孔2ml，置于40℃，5﹪CO2细胞培养箱中培养。进一步的，所述步骤(2)的RT-PCR扩增ChIL-2和ChIL-18基因，具体是分别于6h、20h收集培养细胞，4℃2000rpm/min离心15min，用1mlRPMI1640重新悬浮细胞，按TrizolReagent使用说明书提取总RNA：1×107个细胞加1mlTrizol剧烈振荡，4℃12000rpm/min离心10min，吸取上清至新的Ep管，加200μl氯仿，用力振荡，15～30℃放置2～3min，4℃12000rpm/min离心15min，小心吸取最上层的无色的水相层至新管，加1倍体积的异丙醇，混匀，4℃12000rpm/min离心10min，弃上清，加75％的乙醇洗涤RNA的沉淀，倒掉乙醇，空气中干燥或真空干燥10～15min，加入25u1DEPC处理过的水溶解RNA，用琼脂糖电泳检验RNA提取效果，提取的鸡脾脏淋巴细胞总RNA于-70℃保存备用。进一步的，所述步骤(3)的RT-PCR扩增ChIL-2和ChIL-18基因，具体包括①引物设计与合成，②RT-PCR扩增基因；所述引物设计与合成，具体是根据GeneBank中ChIL-2和ChIL-18的基因序列，应用Primer软件设计扩增ChIL-2和ChIL-18的特异性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，用于扩增ChIL-2和ChIL-18基因的引物具体如下：所述RT-PCR扩增基因，具体是将干燥后的RNA用15-20μl的DEPC水溶解，并吸取11.5μl的RNA加至一个新的PCR管里，并加入2μl的引物，PCR仪中70℃5min，取出混合物，冰浴1min后，依次加入2μl的dNTP、1μl的逆转录酶、0.5μl的RNA酶抑制剂和4μl的5×Buffer，样品放入PCR仪，37℃1h，95℃10min，于4℃或-20℃保存备用；将所得到的反转录的cDNA产物进行Taq酶PCR扩增；PCR反应体系如下所示：50μLPCR反应条件如下所示：反应之后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，胶回收DNA片段。进一步的，所述步骤(4)的PCR产物的克隆与酶切鉴定，其具体是将回收的DNA片段克隆到pMD19-T载体，具体操作如下：PCR产物加A体系如下：10μL连接pMD19-T载体：10μL16℃反应30min或者4℃连接过夜，转化DH10B感受态细胞。进一步的，所述步骤(5)的ChIL-2和ChIL-18基因阳性克隆测序分析，具体是待转化后的平板培养16小时后，挑取单菌落于10μL无菌水中，取1μL菌液作为模板，使用特异性引物于TaqDNA聚合酶体系进行菌落PCR鉴定，取阳性菌转接新鲜培养基，当菌液培养至适当浓度时，进行质粒小量提取，选择合适的酶切位点进行酶切鉴定，并将PCR片段测序。进一步的，所述步骤(6)的重组表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)SPF鸡脾淋巴细胞的分离及培养；/n(2)细胞总RNA的提取；/n(3)RT-PCR扩增ChIL-2和ChIL-18基因；/n(4)PCR产物的克隆与酶切鉴定；/n(5)ChIL-2和ChIL-18基因阳性克隆测序分析；/n(6)重组表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18的构建；/n(7)重组质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18在大肠杆菌中进行表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)SPF鸡脾淋巴细胞的分离及培养；
(2)细胞总RNA的提取；
(3)RT-PCR扩增ChIL-2和ChIL-18基因；
(4)PCR产物的克隆与酶切鉴定；
(5)ChIL-2和ChIL-18基因阳性克隆测序分析；
(6)重组表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18的构建；
(7)重组质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18在大肠杆菌中进行表达。


2.如权利要求1所述的重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的SPF鸡脾淋巴细胞的分离及培养，具体是将鸡心脏采血处死，无菌取鸡脾置于冷的Hanks液中，分离掉被膜和脂肪组织后，在200目铜网上研磨，制成单细胞悬液，2000rpm/min离心15min，沉淀细胞悬浮于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，取一离心管，事先加入4ml淋巴细胞分离液，将等体积的细胞悬液缓慢加入到淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，2000rpm/min离心15min，收集淋巴细胞，用RPMI1640培养液离心洗涤2次，计活细胞数量，调整细胞浓度至1×107个/ml，加于6孔细胞培养板，每孔2ml，置于40℃，5﹪CO2细胞培养箱中培养。


3.如权利要求1所述的重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的RT-PCR扩增ChIL-2和ChIL-18基因，具体是分别于6h、20h收集培养细胞，4℃2000rpm/min离心15min，用1mlRPMI1640重新悬浮细胞，按TrizolReagent使用说明书提取总RNA：1×107个细胞加1mlTrizol剧烈振荡，4℃12000rpm/min离心10min，吸取上清至新的Ep管，加200μl氯仿，用力振荡，15～30℃放置2～3min，4℃12000rpm/min离心15min，小心吸取最上层的无色的水相层至新管，加1倍体积的异丙醇，混匀，4℃12000rpm/min离心10min，弃上清，加75％的乙醇洗涤RNA的沉淀，倒掉乙醇，空气中干燥或真空干燥10～15min，加入25u1DEPC处理过的水溶解RNA，用琼脂糖电泳检验RNA提取效果，提取的鸡脾脏淋巴细胞总RNA于-70℃保存备用。


4.如权利要求1所述的重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的RT-PCR扩增ChIL-2和ChIL-18基因，具体包括①引物设计与合成，②RT-PCR扩增基因；
所述引物设计与合成，具体是根据GeneBank中ChIL-2和ChIL-18的基因序列，应用Primer软件设计扩增ChIL-2和ChIL-18的特异性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，用于扩增ChIL-2和ChIL-18基因的引物具体如下：



所述RT-PCR扩增基因，具体是将干燥后的RNA用15-20μl的DEPC水溶解，并吸取11.5μl的RNA加至一个新的PCR管里，并加入2μl的引物，PCR仪中70℃5min，取出混合物，冰浴1min后，依次加入2μl的dNTP、1μl的逆转录酶、0.5μl的RNA酶抑制剂和4μl的5×Buffer，样品放入PCR仪，37℃1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳雯，郑一民，周晴云，覃静，
申请(专利权)人：南宁学院，
类型：发明
国别省市：广西;45