布鲁顿酪氨酸激酶小分子抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种以布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase,BTK)为靶点的小分子抑制剂及其应用，属于制药技术领域。本发明专利技术以BTK为靶点，利用基于对接的虚拟筛选和体外生物活性评价相结合进行小分子抑制剂的筛选。体外BTK激酶活性测试结果表明，筛选的化合物中有两个具有较好的BTK抑制活性。所发现的小分子可以为治疗BTK有关的疾病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤的新药研发提供基础。本发明专利技术的先导化合物可进行进一步的结构优化，具有较好的应用前景。

Small molecule inhibitor of Bruton tyrosine kinase and its application

【技术实现步骤摘要】
布鲁顿酪氨酸激酶小分子抑制剂及其应用
本专利技术属医药化学
，具体涉及以布鲁顿酪氨酸激酶(Brutontyrosinekinase,BTK)蛋白为靶点抑制人BTK激酶活性的先导化合物及其药用盐在制备BTK相关的病症药物中的应用。
技术介绍
BTK最初被鉴定为人类X连锁无球蛋白血症(XLA)中的缺陷蛋白，是细胞质酪氨酸激酶的Src相关的Tec家族的成员并在B细胞的发育和激活中起着至关重要的作用。BTK主要在造血细胞例如B细胞，肥大细胞和巨噬细胞中表达，但在T细胞，自然杀伤细胞和血浆中并不常见。BTK抑制剂因其在癌症和自身免疫疾病如B细胞恶性肿瘤中的治疗潜力而备受关注。2013年，依鲁替尼(ibrutinib)被FDA批准为BTK的首创新抑制剂用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL),现在处于单一或联合治疗其他适应症的临床评估中。目前的BTK小分子抑制剂分为不可逆和可逆的。不可逆抑制剂通过迈克尔加成与BTK中ATP结合位点中的C481共价结合，从而产生很好地抑制作用。需要注意的是，大多数处于临床阶段的BTK抑制剂是不可逆的。不可逆抑制剂具有强大的功效，但是，近几年，由于广泛使用ibrutinib，与ibrutinib结合的C481被其他的氨基酸所替换，这将改变ibrutinib与btk的不可逆共价结合，降低ibrutinib对BTK的亲和力，最终导致耐药性。因此，一个潜在的策略是开发不与C481相互作用的非共价抑制剂，以克服ibrutinib抗BTKC481耐药突变。如最近的非共价抑制剂BMS-986142(Fenebrutinib)表现出令人鼓舞的疗效，目前处于Ⅱ期临床研究，可能会为可逆BTK抑制剂带来突破。因此，发现有效且安全的可逆抑制剂以及获得临床疗效仍是主要挑战。随着计算机技术在药物研发领域的应用，计算机虚拟筛选为药物先导化合物的发现提供了一种快速、高效的筛选技术。该技术针对重要疾病特定靶标生物大分子三维结构，从现有小分子数据库中，搜寻与靶标结合较好的化合物，大大降低实验筛选化合物数量，缩短了研发周期。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供靶向人BTK蛋白的先导化合物及其药用盐在制备BTK激酶抑制剂中的应用。其中所述的BTK介导的疾病选自一下疾病中的至少一种：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤。本专利技术在对靶标BTK蛋白的抑制剂结合口袋的研究基础上，筛选得到具有新结构实体的靶向BTK蛋白的小分子抑制剂化合物Ⅰ和化合物Ⅱ，所述的靶向BTK蛋白的小分子抑制剂为针对BTK与ATP结合位点的小分子结构的化合物。本专利技术通过基于对接的虚拟筛选，通过Lipinski’s五规则筛选、打分函数评分、结合自由能计算、对人BTK蛋白激酶活性的抑制试验等多因素综合分析，最终得到了对BTK有抑制活性的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ。本专利技术的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ经实验证实，在体外有显著的抑制人BTK激酶活性效果。本专利技术的化合物可进一步的结构优化，制备治疗BTK蛋白相关疾病(包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤)的制剂或药物。本专利技术通过三轮筛选出2个具有BTK抑制活性的化合物；所述化合物具有如下特征：化合物Ⅰ英文名称：3-(2-((4-chlorophenethyl)amino)-2-oxoethyl)-4-methyl-2-oxo-2H-chromene-7,8-diyldiacetate.化合物结构：化合物Ⅱ，英文名称：3-(3,4-dimethoxyphenyl)-N-(2-(yridin-2-yl)ethyl)-1H-pyrazole-5-carboxamide化合物结构：表1显示了筛选得到的两个化合物的理化性质和BTK激酶抑制活性数据。表1为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本专利技术的靶向人BTK蛋白的化合物进行详细的描述。附图说明图1为BTK激酶非活性状态的结构。图2为GDC-0834与BTK的结合模式图。图3为化合物-Ⅰ与BTK的对接结合模式图。图4为化合物-Ⅱ与BTK的对接结合模式图。具体实施方式实施例11、小分子化合物Ⅰ和Ⅱ的虚拟筛选方法(1)蛋白准备在蛋白数据库(https://www.rcsb.org/)中搜寻并获得BTK的三维结构(PDBcode:5P9F),该结构为BTK与其抑制剂GDC-0834的复合物；使用薛定谔软件包中maestro10.1(2015-01,version10.1,https://www.schrodinger.com/)的Proteinpreparationwizard模块进行准备，其中，首先对蛋白进行加氢，并删除蛋白中的水分子、乙二醇、丙三醇，然后在OPLS_2005力场下对蛋白进行能量优化和最小化。(2)配体准备小分子结构在chemdiv数据库中获取，使用薛定谔软件包中maestro10.1的Ligprep模块对配体进行优化，分别利用Lipinski’s五规则，是否具有可反应基团，对化合物进行对接前筛选工作。(3)格点生成使用薛定谔软件以抑制剂GDC-0834为格点盒子的中心生成格点文件。(4)基于分子对接的虚拟筛选将准备的小分子配体与靶蛋白进行对接，首先使用薛定谔软件中maestro10.1里的Glide的HTVS(high-throughputvirtualscreening)模式进行初筛，并选取打分前10％的化合物用SP(standardprecision)模式进行复筛，然后根据打分选取前10％的化合物用XP(extraprecision)模式进行精筛，最后保留打分前4000个化合物，然后对这些分子用薛定谔软件包中Canvas2.3模块进行K-meansclustering聚类，最后根据对接打分、能量打分、配体的结合构象对化合物进行挑选，并筛选出具有BTK抑制活性的化合物。2、激酶活性测试化合物对布鲁顿酪氨酸激酶的抑制试验用酶联免疫方法(ELISA)进行检测。将浓度为20μg/mL的底物肽(Glu-Tyr)4:1(Sigma,StLouis,MO)包被到96孔酶标板内。在激酶反应缓冲液(50mmol/LTris-HCl,pH7.4,20mmol/LMgCl2,0.1mmol/LMnCl2,1mmol/LDTT)加入酪氨酸激酶、DMSO溶解的化合物和ATP(终浓度为5μmol/L)，37℃孵育1h。将抗酪氨酸磷酸化抗体PY99(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)加入96孔酶标板内，25℃孵育30min，用PBS洗板，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，25℃孵育30min，用PBS洗板。加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)避光显色15min，加入2M的H2SO4终止本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.化合物Ⅰ和化合物Ⅱ及其药用盐在制备靶向人BTK蛋白药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.化合物Ⅰ和化合物Ⅱ及其药用盐在制备靶向人BTK蛋白药物中的应用。


2.权利要求1中的两个化合物及其药用盐在制备类风湿性关节炎疾病药物中的应用。


3.权利要求1中的两个化合物及其药用盐在制备系统性红斑狼疮疾病药物中的应用。


4.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚小军，葛慧珍，毛龙飞，彭立增，刘焕香，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62