【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于微阵列的多重病原体分析及其应用相关申请的交叉引用本国际申请要求了2018年10月11日提交的未决的美国申请序列号16/158,276的35U.S.C.§120下的优先权的权益，其是在35U.S.C.§120下未决的于2018年3月8日提交的美国申请序列号15/916,036和美国序列号15/916,062的部分延续，并且它们全部并入本文。
技术介绍
专利技术的领域本专利技术属于基于DNA的病原体和植物分析的
更具体地，本专利技术属于使用多重测试法和用于固定核酸探针的三维晶格微阵列技术，对植物、农业、食品和水材料进行病原体分析的
相关技术的描述用于识别微生物病原体的当前技术依赖于已建立的临床微生物学监测。使用标准培养和药敏试验进行病原体识别。这些试验需要投入大量的时间、精力、成本以及不稳定的产品。对于试验大批量的样品，当前的技术是不理想的。基于培养的试验充满了误差，包括假阳性和假阴性，以及菌落形成单位(CFU)的不可靠的定量。存在存活的但不可培养的微生物的问题，这些微生物不能使用常规培养方法培养。...
【技术保护点】
1.一种三维晶格微阵列系统，其包括：/n具有前表面和背面的固体支持物；/n多个双功能聚合物接头，每个接头具有顶部结构域和底部末端，所述底部末端与固体支持物连接；和/n多个核酸探针，所述核酸探针与多个双功能聚合物接头的每个接头的顶部结构域连接。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180308 US 15/916,062;20180308 US 15/916,036;20181.一种三维晶格微阵列系统，其包括：
具有前表面和背面的固体支持物；
多个双功能聚合物接头，每个接头具有顶部结构域和底部末端，所述底部末端与固体支持物连接；和
多个核酸探针，所述核酸探针与多个双功能聚合物接头的每个接头的顶部结构域连接。
2.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，多个双功能聚合物接头中的每个接头还包含与其顶部结构域的末端共价连接或内部共价连接的荧光标记。
3.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，所述固体支持物进一步地包括多个连接到其前表面的化学可活化基团，其中所述多个双功能聚合物接头通过它们的底部末端与多个化学可活化基团中的每个化学可活化基团共价连接。
4.根据权利要求3所述的三维晶格微阵列系统，其中所述化学可活化基团是环氧硅烷基、马来酰亚胺基、氨基或活化的羧酸酯。
5.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头包括在底部末端的第一反应性部分或在顶部结构域的第二反应性部分或其组合，所述第一反应性部分与所述固体支持物中的化学可活化基团上共价连接，所述第二反应性部分与多个核酸中的每个核酸共价连接。
6.根据权利要求5所述的三维晶格微阵列系统，其中所述第一反应性部分是氨基、硫醇基、醛基或羧酸酯。
7.根据权利要求5所述的三维晶格微阵列系统，其中所述第二反应部分是核苷酸碱基、氨基酸或氨基糖。
8.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头在底部末端具有吸附基团，以非共价地连接到所述固体支持物。
9.根据权利要求8所述的三维晶格微阵列系统，其中所述吸附基团是单链核酸、胺-多糖，或延伸的平面疏水基团。
10.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头是寡核苷酸、氨基多糖、聚胺或聚氨基酸。
11.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，多个核酸探针中的每个核酸探针在5'端和3'端具有至少三个末端胸腺嘧啶核苷碱基。
12.根据权利要求11所述的三维晶格微阵列系统，其中所述胸腺嘧啶核苷碱基与多个双功能聚合物接头中的每个接头上的第二反应性部分共价连接。
13.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，所述核酸探针具有与病原体、植物或动物中的特征核苷酸序列互补的序列。
14.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，其中所述固体支持物是硼硅酸盐玻璃、惰性金属、热塑性丙烯酸树脂、环烯烃聚合物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、尼龙、陶瓷、工程化的碳表面或其组合。
15.一种制造三维晶格微阵列系统的方法，其包括以下步骤：
使权利要求1所述的系统中的固体支持物与制剂接触，所述制剂包含：
(i)多个核酸探针；
(ii)多个双功能聚合物接头；和
(iii)溶剂混合物，其包含水和沸点高于100℃的水溶性的液体；
将多个双功能聚合物接头中的每个接头的底部末端连接到固体支持物的前表面作为第一连接反应；
将溶剂混合物中的水蒸发，从而浓缩多个核酸探针和连接到固体支持物上的多个双功能聚合物接头；
将每个核酸探针共价连接到多个双功能聚合物接头的每个接头的顶部结构域作为第二连接反应；和
至少洗涤固体支持物一次以除去未连接的双功能聚合物接头和核酸探针，以制造三维晶格微阵列系统。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一连接反应是吸附。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一连接反应是通过固体支持物上的化学可活化基团与多个双功能聚合物接头的每个接头的底部末端上的第一反应性部分之间的共价偶联而实现的。
18.根据权利要求15所述的方法，其中水溶性的液体是甘油、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇或其组合。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一连接反应在0℃和40℃之间的温度下发生。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二连接在0℃和40℃之间的温度下发生。
21.根据权利要求15所述的方法，其中第二连接反应是通过在多个双功能聚合物接头中的每个接头的顶部结构域处的第二反应性部分与多个核酸探针的光化学交联而实现的。
22.一种可定制的微阵列试剂盒，其包括：
权利要求1所述的三维晶格微阵列系统中的固体支持物和多个双功能聚合物接头；
多个核酸探针，每个核酸探针具有与病原体、植物或动物中的特征核苷酸序列互补的序列；
溶剂混合物；和
使用试剂盒的说明书。
23.根据权利要求22所述的可定制的微阵列试剂盒，其中所述核酸探针在5'端和3'端具有至少三个末端胸腺嘧啶核苷碱基。
24.根据权利要求22所述的可定制的微阵列试剂盒，其中所述溶剂混合物包括水与甘油、二甲基亚砜(DMSO)或丙二醇中的其中一种的混合物，其体积比为约10:1至约100:1。
25.一种检测植物样品中病原体的方法，其包括：
a)采集植物组织样品；
b)从植物组织样品中分离包含DNA的总核酸；
c)使用至少一个第一引物对在单次测试中串联地进行第一扩增，以获得一个或多个病原体特异性的第一扩增子，其中每个第一引物对包含对至少一种病原体的DNA有选择性的正向引物和反向引物；
d)使用病原体特异性的第一扩增子作为模板和至少一个第二引物对串联地进行第二扩增，以获得荧光标记的第二扩增子，其中每个引物对都标记有荧光标记并包含具有与病原体特异性第一扩增子的内部侧翼区互补的序列的正向和反向引物；和
e)使用权利要求1所述的三维晶格微阵列系统执行以下步骤：
(i)将第二扩增子与对病原体DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针进行杂交，其中通过多个双功能聚合物接头中的每个接头将核酸探针固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置；
(ii)至少洗涤微阵列一次；和
(iii)使微阵列成像以检测来自荧光标记的第二扩增子的荧光信号，从而检测植物样品中的病原体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头包括荧光标记，该方法进一步地包括使微阵列成像以检测荧光标记的双功能聚合物接头的荧光信号和将荧光标记的第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的信号上，从而识别在植物样品中检测到的病原体。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述病原体是细菌、真菌、病毒、藻类或原生动物或其组合。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述病原体是细菌，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，或SEQIDNO：5和SEQIDNO：6，或SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，或SEQIDNO：9和SEQIDNO：10，或SEQIDNO：11和SEQIDNO：12，或SEQIDNO：137和SEQIDNO：138所示的序列，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，或SEQIDNO：21和SEQIDNO：22，或SEQIDNO：23和SEQIDNO：24，或SEQIDNO：25和SEQIDNO：26，或SEQIDNO：27和SEQIDNO：28，或SEQIDNO：29和SEQIDNO：30，或SEQIDNO：141和SEQIDNO：30所示的序列，并且其中核酸探针具有SEQIDNO：37-85所示的序列。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述病原体是真菌，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，或SEQIDNO：15和SEQIDNO：16，或SEQIDNO：135和SEQIDNO：136所示的序列，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQIDNO：31和SEQIDNO：32，或SEQIDNO：33和SEQIDNO：34，或SEQIDNO：139和SEQIDNO：140所示的序列，并且其中核酸探针具有SEQIDNO：86-125所示的序列。
30.根据权利要求25所述的方法，其中荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子中的荧光标记与荧光标记的双功能聚合物接头中的荧光标记不同。
31.一种在单次测试中同时检测来自植物和病原体的DNA的方法，其包括：
a)采集可能包含一种或多种病原体的植物组织样品；
b)将包含来自至少植物组织和一种或多种病原体的DNA的总核酸分离；
c)使用至少一个病原体DNA选择性第一引物对和至少一个植物DNA选择性第一引物对在单次测试中在总核酸上串联地进行第一扩增，以获得病原体特异性第一扩增子和植物特异性第一扩增子；
d)使用病原体特异性第一扩增子和植物特异性第一扩增子作为模板和标记有荧光标记并具有与病原体特异性第一扩增子的内部侧翼区互补的序列的至少一个第二引物对和标记有荧光标记并且具有与植物特异性第一扩增子中的内部侧翼区互补的序列的至少一个第二引物对，串联进行第二扩增，以获得荧光标记的病原体特异性第二扩增子和荧光标记的植物特异性第二扩增子；
e)使用权利要求1所述的三维晶格微阵列系统执行以下步骤：
(i)将荧光标记的病原体特异性第二扩增子和荧光标记的植物特异性第二扩增子与对病原体DNA和植物DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针杂交，其中通过荧光标记的双功能聚合物接头将核酸固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置；
(ii)至少洗涤微阵列一次；和
(iii)使微阵列成像以检测来自荧光标记的病原体特异性第二扩增子和来自荧光标记的植物特异性第二扩增子的荧光信号，从而同时检测样品中的病原体和植物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头均包括荧光标记，所述方法进一步地包括以下步骤：使微阵列成像以检测荧光标记的双功能聚合物接头的荧光信号，和将荧光标记的植物特异性第二扩增子和荧光标记的病原体特异性第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的信号上从而同时识别在植物样品中检测到的病原体和植物。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述病原体是细菌，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，或SEQIDNO：5和SEQIDNO：6，或SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，或SEQIDNO：9和SEQIDNO：10，或SEQIDNO：11和SEQIDNO：12，或SEQIDNO：137和SEQIDNO：138所示的序列，第二扩增正向和反向引物对分别具有在SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，或SEQIDNO：21和SEQIDNO：22，或SEQIDNO：23和SEQIDNO：24，或SEQIDNO：25和SEQIDNO：26，或SEQIDNO：27和SEQIDNO：28，或SEQIDNO：29和SEQIDNO：30，或SEQIDNO：141和SEQIDNO：30所示的序列，并且其中核酸探针具有SEQIDNO：37-85所示的序列。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述病原体是真菌，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，或SEQIDNO：15和SEQIDNO：16，或SEQIDNO：135和SEQIDNO：136所示的序列，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQIDNO：31和SEQIDNO：32，或SEQIDNO：33和SEQIDNO：34，或SEQIDNO：139和SEQIDNO：140所示的序...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·E·霍根，M·R·梅，F·H·埃格斯，
申请(专利权)人：帕瑟根迪艾斯有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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