一种检测血浆中肝细胞来源外泌体的方法技术

本发明专利技术对现有外泌体提取方法进行了改进，公开了一种从血浆中提取外泌体的方法，该外泌体提取方法操作简单、效率高、得到的外泌体得率高，纯度高，最重要的是可以保持外泌体完整的结构和生物功能。外泌体提取后，本发明专利技术选择识别效果最佳的肝细胞标志性蛋白ALB和外泌体标志性蛋白CD63搭配进行提取物标记，然后利用外泌体的Amnis量化成像分析流式细胞仪，利用最佳的检测参数可以对通过流动室中的每个细胞进行成像，实现了对细胞图像进行多参数量化分析，获得全新的细胞形态统计学数据，精确而灵敏地识别出了血浆中肝细胞来源的外泌体。本发明专利技术得到的肝细胞来源的外泌体表达谱可作为肝再生评估的的工具，具有巨大的发展潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种检测血浆中肝细胞来源外泌体的方法
本专利技术涉及一种外泌体的检测方法，具体地说是一种检测血浆中肝细胞来源的外泌体的方法。
技术介绍
外泌体是直径30～100nm、具有脂质双分子层结构的天然封闭囊泡，可由多种细胞类型合成和释放，可作为细胞间通信中的介质，运输信息货物，如蛋白质，脂质和核酸，在疾病的发生发展中发挥重要作用，是近年来研究的热点。人体内几乎所有类型的细胞都可以产生并释放外泌体，因此血浆中含有丰富的外泌体。不同细胞来源的外泌体携带着来源于相应细胞的蛋白分子，将组织细胞内部的信息带到外周血中，因此如何分离鉴定血浆中肝细胞来源的外泌体对于肝脏疾病的诊断和治疗意义重大。在肝病患者中，由于肝脏的细胞受到不同程度的损伤，患者血浆中存在着来源于肝脏细胞的外泌体，比如肝细胞来源的外泌体、胆管上皮细胞来源的外泌体、内皮细胞来源的外泌体、Kuffer细胞来源的外泌体、淋巴细胞来源的外泌体、肝星状细胞来源的外泌体等。其中肝细胞是肝脏组织的主要构成细胞，占肝脏细胞总数的60％～80％，并且肝脏疾病主要是肝细胞的结构和功能受到破坏而引起，因此我们检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血浆中肝细胞来源外泌体的方法，其特征在于所述方法步骤如下：/n(1)首先对血浆样本进行外泌体提取，第一次常温低速离心提取，离心力2000～3000g，离心10～20分钟，取上清液；/n(2)第二次低速离心提取，离心力10000～12000g，离心温度4度，离心30～60分钟，取上清液；/n(3)第三次真空环境下高速离心，将步骤(2)上清液倒入离心管后用PBS补液至距管口1～2mm处，启动真空，当真空值<50μm时启动离心，离心力100000～120000g，离心时间大于1小时，离心温度4度，然后停止离心释放真空；/n(4)离心好后，弃上清液，PBS重悬；/n(5)外泌体染色：...

【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中肝细胞来源外泌体的方法，其特征在于所述方法步骤如下：
(1)首先对血浆样本进行外泌体提取，第一次常温低速离心提取，离心力2000～3000g，离心10～20分钟，取上清液；
(2)第二次低速离心提取，离心力10000～12000g，离心温度4度，离心30～60分钟，取上清液；
(3)第三次真空环境下高速离心，将步骤(2)上清液倒入离心管后用PBS补液至距管口1～2mm处，启动真空，当真空值<50μm时启动离心，离心力100000～120000g，离心时间大于1小时，离心温度4度，然后停止离心释放真空；
(4)离心好后，弃上清液，PBS重悬；
(5)外泌体染色：加入直标抗体ALB-AF488和CD63-PE，室温避光30分钟后加入PBS离心，离心力100000～120000g，离心时间70min～120min；
(6)倒掉管内液体，用管壁回流液体避光震荡重悬；
(7)利用Amnis量化成像分析流式...

【专利技术属性】
技术研发人员：时红波，陈德喜，焦彦，许萍，时红林，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京佑安医院，
类型：发明
国别省市：北京;11