一种烟草受体蛋白基因及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种烟草受体蛋白基因及其克隆方法与应用。所述的烟草受体蛋白基因包括

【技术实现步骤摘要】
一种烟草受体蛋白基因及其克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种烟草受体蛋白基因及其克隆方法与应用。
技术介绍
烟碱是栽培烟草中特征性化合物，深刻影响卷烟品质。烟碱的合成受到植物激素的调控，比如生长素，乙烯以及茉莉酸。其中茉莉酸调控烟碱合成途径的研究较为清晰。在无茉莉酸的情况下，JAZ蛋白结合MYC2蛋白从而抑制MYC2蛋白激活烟碱合成途径基因的功能。在茉莉酸存在的情况下，茉莉酸通过结合受体蛋白COI1激活JAZ蛋白的降解(通过26S蛋白酶途径)，JAZ蛋白的降解释放MYC2，从而激活烟碱合成途径相关基因，提高烟叶烟碱含量。通过基因手段调控烟碱含量已有较多的研究，比如通过过量表达转录因子基因，如ERF,MYC2等能够显著提高烟叶烟碱含量；通过RNA干涉技术降低烟碱合成途径基因，如QPT等能够显著降低烟叶烟碱含量。近年来，基因组编辑技术也应用于调控烟碱含量，比如敲除BBL家族基因获得烟碱含量极低的烟草。随着新型烟草制品的迅猛发展，市场对不同烟碱含量烟叶的特殊化需求日益增加，其中包括低烟碱含量烟草。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种烟草受体蛋白基因；第二目的在于提供所述的烟草受体蛋白基因的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草受体蛋白基因的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的烟草受体蛋白基因包括NtCOI1-1和NtCOI1-2，其核苷酸序列如SEQID:NO.1和SEQID:NO.2所示。本专利技术的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：A、提取烟草根部组织RNA，反转录得到第一链cDNA；B、以cDNA为模板，根据烟草受体蛋白基因NtCOI1-1和烟草受体蛋白基因NtCOI1-2序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物；C、纯化扩增产物与载体链接，具体过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μL-BluntⅡ-TOPO(Invitrogen)混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。本专利技术的第三目的是这样实现的，所述的烟草受体蛋白基因在获得调控烟草烟碱含量的转基因烟草植株中的应用。本专利技术还提供一种利用CRSIPR/CAS9编辑技术对烟草NtCOI1-1、2基因进行功能鉴定的方法，具体包括以下步骤：(1)构建CRISPR/CAS9载体A、根据NtCOI1-1、2基因组序列设计CRISPR/CAS9靶位点(PAM)，即GAATTGGTTGCGATGAATCGGGG。B、靶位点引物设计根据A设计的靶位点合成靶位点引物：P1：5’-ATTGGAATTGGTTGCGATGAATCG-3’，P2：5’-AAACCGATTCATCGCAACCAATTC-3’；C、在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，NtCOI1-1-SdF:5’-AGCAACACTACTCTGCCACT-3’，NtCOI1-1-SdR:5’-TACTATAGCTCAGTAGCAAGC-3’，扩增长度为819bp；NtCOI1-2-SdF:5’-ACTAACATCCGCTGTTACGC-3’，NtCOI1-2-SdR:5’-TACAGCTCACTAGTAAGTTGC-3’，扩增长度为1046bp。D、制备dsDNA将步骤B中设计合成的引物通过退火形成互补DNAoligo，具体步骤如下：反应体系50μL，包括P120μL，P220μL，10×Annealingbuffer5μL，灭菌双蒸水5μL。退火程序为：95℃，5min；90℃，1min；80℃，1min；70℃，1min；60℃，1min；50℃，1min；40℃，1min；30℃，1min；20℃，1min；10℃，1min。E、酶切pHSE401载体，并与步骤D所制备dsDNA进行连接。利用BsaI酶对pHSE401载体进行酶切，酶切体系50μL，包括：质粒5μL，10×buffer5μL，BsaI2μL，灭菌双蒸水38μL。37℃酶切1h。酶切后对酶切产物进行电泳检测分析，可见1200bp和11520bp两个条带，回收11520bp的酶切产物备用；利用T4DNA连接酶将所回收的大片段酶切产物与步骤D所制备dsDNA进行连接，连接体系20μL：所回收载体酶切产物3μL，退火所形成dsDNA产物10μL，T4DNAbuffer2μL，T4DNA连接酶1μL，灭菌双蒸水4μL。16℃过夜连接；F、测序验证将步骤E中连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性克隆(pHSE401载体抗性为kan)并进行菌落PCR检测，菌落PCR检测时，所用引物设计为:U6-26pF：5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’；P2：5’-AAACCGATTCATCGCAACCAATTC-3’；对菌落PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，测序时所用引物为：U6-26p-F:5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’。对测序结果进行分析，选择构建正确的克隆(pHSE401-COI1/2)保存备用。(2)农杆菌转化从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞(C58C1)，放置冰上溶解后加入载体pHSE401-COI1/24μL；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mLLB液体培养基，28℃、220rpm培养3～4小时；培养物涂布于含有卡那霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2～3天，可见含有目标载体的农杆菌克隆。(3)烟草转化A、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有卡那霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2～3天；刮取划线菌斑接菌于含有卡那霉素和利福平的LB培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到OD＝0.5～0.8时进行侵染；B、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75％乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1％的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15～30分钟；弃溶液，用无菌水冲洗6遍；C、将叶片取出，用无菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌LB液体培养基悬浮菌液中，静置15～20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA(0.02mg/L)、NAA(2mg/L)的MS培养基中25℃暗培养两天；将烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，分化培养基为含有6-BA(0.5mg/L)、NAA(0.1mg/L)、潮霉素(20mg/L)、头孢霉素(500mg/L)的MS培养基，每2～3周本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草受体蛋白基因，其特征在于所述的烟草受体蛋白基因包括

【技术特征摘要】
1.一种烟草受体蛋白基因，其特征在于所述的烟草受体蛋白基因包括NtCOI1-1和NtCOI1-2，其核苷酸序列如SEQID:NO.1和SEQID:NO.2所示。


2.根据权利要求1所述的烟草受体蛋白基因，其特征在于烟草受体蛋白基因NtCOI1-1和烟草受体蛋白基因NtCOI1-2编码的氨基酸序列如SEQID:NO.3和SEQID:NO.4所示。


3.一种权利要求1或2所述的烟草受体蛋白基因的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取烟草根部组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
B、以cDNA为模板，根据烟草受体蛋白基因NtCOI1-1和烟草受体蛋白基因NtCOI1-2序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物；
C、纯化扩增产物与载体链接，具体过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。


4.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丙武，隋学艺，高玉龙，宋中邦，赵璐，李梅云，孔光辉，焦芳婵，吴兴富，李永平，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53