一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用。属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术还提供一种培育提高抗旱性转基因植物的方法，即通过植物过表达载体pBI121‑GaNCED3将目标核苷酸序列导入受体植物中，增加受体植物中GaNCED3的活性或增加目的植物中GaNCED3的含量，或者促进GaNCED3编码蛋白的表达，得到的转基因植物抗旱性高于对照受体植物。本发明专利技术中抗旱性提高表现在，在甘露醇模拟的干旱胁迫下，转基因植物种子萌发率、绿苗率以及根长高于受体植物，并且在自然干旱下，转基因植株叶片丙二醛含量小于受体植株，游离脯氨酸的积累量大于受体植株。

【技术实现步骤摘要】
一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用
本专利技术涉及植物基因工程
，更具体的说是涉及一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用。
技术介绍
干旱是影响植物生长发育的主要因素之一。棉花是我国重要的经济作物。在全国水资源形势异常严峻的情况下，要保持棉花产业的可持续发展、稳定全国棉花产量，必须提高棉花的抗旱性。利用基因工程手段培育抗旱棉花材料是解决该问题的一条有效途径。植物抗旱反应机理复杂，涉及多种抗旱机制和信号传导途径，目前虽然已克隆到了一些棉花抗旱相关基因，但是数量有限，还有许多未知的重要基因等待发掘。9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是ABA合成过程中的关键限速酶，被证实广泛参与植物生长发育进程及对非生物胁迫的应答。挖掘棉花中干旱相关的NCED基因，并应用于培育抗旱棉花材料，对于利用基因工程手段遗传改良棉花具有重要意义。因此，如何提供一种具有抗旱功能的基因、蛋白质，以及一种提高植物抗旱性的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种抗旱性调控基因GaNCED3，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；表达蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术还提供了含有上述GaNCED3的生物材料，生物材料为表达载体、克隆载体或工程菌。优选的：表达载体包括：A：以GaNCED3-V-F：GAGTAAGGTTACCGAATTCTCTTCATTTGCCTAAGCAACAATCAC，SEQIDNO：3和GaNCED3-V-R：TGAGCTCGGTACCGGATCCTAGACTCCTTGTATGCAATCCGG，SEQIDNO：4为引物，以PEG处理2h的叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，得到长度为300bp的PCR产物，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；采用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切所述PCR产物和pTRV-RNA2载体，构建能够抑制GaNCED3编码蛋白表达的重组质粒pTRV2-GaNCED3；或，B：以GaNCED3-F：GAACACGGGGGACTCTAGAATGGCTTCATCAACAGCAGC，SEQIDNO：6和GaNCED3-R：TGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAGGCCTGTTTTTCCAAGTCC，SEQIDNO：7为引物，以PEG处理2h的叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，采用限制性内切酶XbaI和ScaI双酶切PCR产物和pBI121载体，构建抗旱基因GaNCED3过表达载体pBI121-GaNCED3。本专利技术还提供了上述GaNCED3或上述生物材料在提高植物抗旱性中的应用，其中，植物为单子叶植物或双子叶植物。本专利技术还提供了上述GaNCED3或上述生物材料在制备转基因植物中的应用，其中，植物为单子叶植物或双子叶植物。本专利技术还提供了上述GaNCED3或上述生物材料在植物育种中的应用，其中，植物为单子叶植物或双子叶植物。优选的：育种的目的为提高植物抗旱性，双子叶植物为棉花或拟南芥；棉花为亚洲棉。本专利技术还提供了一种提高植物抗旱性的方法，方法包括：使植物过表达上述GaNCED3；其中，植物为单子叶植物或双子叶植物；双子叶植物为棉花或拟南芥；棉花为亚洲棉。本专利技术还提供了一种鉴定植物的方法，植物是包含上述GaNCED3的单子叶植物或双子叶植物，或包含上述生物材料的单子叶植物或双子叶植物，或者由上述方法获得的单子叶植物或双子叶植物，其包括如下步骤：测定植物是否包含上述GaNCED3；检测为qPCR检测，检测引物序列为：GaNCED3-qPCR-F:5’-TTCTGAATCCGAGCAAGTGA-3’，SEQIDNO：8；GaNCED3-qPCR-R:5’-CTTTGGCGAATCCTGACACT-3’，SEQIDNO：9。优选的：qPCR反应程序：94℃，3min；35个循环的程序包括94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；最后72℃延伸5min；反应体系：总体积20μl，包括2×TaqPCRMix10μl，GaNCED3-qPCR-F0.5μl，GaNCED3-qPCR-R0.5μl，模板2.0μl，ddH2O7.0μl。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用，取得的技术效果：本专利技术克隆了亚洲棉GaNCED3基因，并通过构建GaNCED3转基因拟南芥和利用VIGS技术构建GaNCED3基因沉默棉花植株，进行了GaNCED3基因抗旱的功能验证。实验证明：GaNCED3过量表达的拟南芥植株抗旱能力增强；GaNCED3沉默棉花植株的抗旱能力降低。过表达GaNCED3基因有助于获得抗旱性提高的植物新种质，为抗旱育种提供新思路。本专利技术提供的GaNCED3是具有抗旱功能的蛋白质，可应用于棉花或其他植物的抗旱育种中，具有重要的应用价值；同时，GaNCED3抗旱功能的揭示，丰富了对棉花NCED类基因功能和作用机制的认识。通过植物过表达载体pBI121-GaNCED3将目标核苷酸序列导入受体植物中，增加受体植物中GaNCED3的活性或增加目的植物中GaNCED3的含量，或者促进GaNCED3编码蛋白的表达，得到的转基因植物抗旱性高于对照受体植物。本专利技术中抗旱性提高表现在，在甘露醇模拟的干旱胁迫下，转基因植物种子萌发率、绿苗率以及根长高于受体植物，并且在自然干旱下，转基因植株叶片丙二醛含量小于受体植株，游离脯氨酸的积累量大于受体植株。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术提供的GaNCED3在组织样品各器官中相对表达量示意图。图2附图为本专利技术提供的GaNCED3基因在PEG模拟的干旱胁迫下的表达变化示意图。图3附图为本专利技术提供的VIGS重悬菌体接种2周后植株表型变化示意图。图4附图为本专利技术提供的VIGS重悬菌体接种2周后GaNCED3基因表达量检测示意图。图5附图为本专利技术提供的VIGS沉默植株在干旱胁迫10d的抗旱表型示意图。图6附图为本专利技术提供的干旱胁迫下GaNCED3沉默植株的生理指标分析示意图。图7附图为本专利技术提供的干旱胁迫下GaNCED3沉默植株中胁迫相关基因的表达分析示意图。图8附图为本专利技术提供的转基因拟南芥T0代种子的抗生素筛选示意图。图9附图为本专利技术提供的转基因拟南芥T1代部分植株的qPCR检测示意图。其中，MarKer：DL2000，泳道1～7：转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗旱性调控基因GaNCED3，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗旱性调控基因GaNCED3，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；表达蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。


2.含有权利要求1所述GaNCED3的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达载体、克隆载体或工程菌。


3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述表达载体包括：
A：以GaNCED3-V-F：GAGTAAGGTTACCGAATTCTCTTCATTTGCCTAAGCAACAATCAC，SEQIDNO：3和GaNCED3-V-R：TGAGCTCGGTACCGGATCCTAGACTCCTTGTATGCAATCCGG，SEQIDNO：4为引物，以PEG处理2h的叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，得到长度为300bp的PCR产物，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；采用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切所述PCR产物和pTRV-RNA2载体，构建能够抑制GaNCED3编码蛋白表达的重组质粒pTRV2-GaNCED3；
或，
B：以GaNCED3-F：GAACACGGGGGACTCTAGAATGGCTTCATCAACAGCAGC，SEQIDNO：6和GaNCED3-R：TGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAGGCCTGTTTTTCCAAGTCC，SEQIDNO：7为引物，以PEG处理2h的叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，采用限制性内切酶XbaI和ScaI双酶切PCR产物和pBI121载体，构建抗旱基因GaNCED3过表达载体pBI121-GaNCED3。


4.权利要求1所述GaNCED3或权利要求2所述生物材料在提高植物抗旱性中的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。


5...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡肖，张建宏，江振兴，迟吉娜，刘存敬，唐丽媛，张素君，李兴河，王海涛，
申请(专利权)人：河北省农林科学院棉花研究所河北省农林科学院特种经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13