一种人胎盘提取液的病毒灭活方法技术

本发明专利技术公开了一种人胎盘提取液的病毒灭活方法，包括如下顺序进行的步骤：1)采用Trizol RNA抽提试剂提取牛胰腺的总RNA；2)牛胰腺的总RNA的RT‑PCR扩增；3)克隆制备牛核糖核酸酶A的表达细菌；4)牛核糖核酸酶A固定5)胎盘提取液病毒核酸酶解灭活。本发明专利技术方法采用基因工程技术，克隆和高效表达RNA酶，并将RNA酶固定化，使胎盘提取液通过固定化RNA酶，使得胎盘提取液中的病毒粒子的核酸被特异性的酶解而失活，达到纯化胎盘提取液的目的，本发明专利技术方法高效、高选择性、催化反应条件温和、无污染、低成本、容易操作、酶可以反复利用，产品单一。

【技术实现步骤摘要】
一种人胎盘提取液的病毒灭活方法
本专利技术涉及一种胎盘的消毒方法和由该方法制备的胎盘提取液，特别涉及一种应用化学物质进行的消毒方法。
技术介绍
人类在战胜疾病和防止过早衰老的探索中，很早就发现了一种能够防止疾病和延缓衰老的特殊药物—紫河车即：胎盘。胎盘是母体和胎儿间进行物质交流的器官，是胚胎与母体组织的结合体。胎儿在母体内生长发育所需的营养物质全部来自胎盘，同时，母体的一些病毒如风疹、肝炎、艾滋病毒等也会通过胎盘传播给胎儿。所以，胎盘是一个营养和病毒可能同时存在的组织。病毒是一类个体微小，无完整细胞结构，含单一核酸(DNA或RNA)型，必须在活细胞内寄生并复制的非细胞型微生物，由蛋白质和核酸组成。病毒体积非常微小，结构极其简单，具有高度的寄生性，完全依赖宿主细胞的能量和代谢系统，获取生命活动所需的物质和能量，离开宿主细胞，她只是一个大的化学分子，停止活动，可制成蛋白质结晶，为一个非生命体，遇到宿主细胞它会通过吸附、进入、复制、装配、释放子代病毒而显示典型的生命体特征，所以病毒是介于生物与非生物的一种原始的生命体。病毒虽然不具有完整的细胞结构，但是病毒同所有生物一样，具有遗传、复制、变异、进化等生命特征。病毒根据其遗传物质组成及其复制方式分为DNA病毒、RNA病毒、反转录病毒。其中DNA病毒很少，基本上都是RNA病毒。DNA病毒只要细胞表面有合适的受体，就能够通过胞吞或膜融合的方式进入细胞；RNA病毒的遗传信息保存在RNA上，因此复制过程通常发生在细胞质中。RNA病毒是用其自身的RNA复制酶来对基因组进行复制；反转录病毒基因组的复制是采用反转录的方式来完成的，即利用RNA模板来合成DNA。遗传物质为RNA的反转录病毒以DNA为中间物来复制其基因组，而遗传物质为DNA的反转录病毒则以RNA为中间物来复制。反转录病毒常常可以将通过反转录合成的DNA整合到宿主细胞的基因组中。虽然胎盘具有抑制皮炎及抗过敏；溶解老化的角质、美化肌肤；修复受损的器官及皮肤组织；增强生理功能、提高免疫力，制造抗体；调节和平衡内分泌，延长青春期；增加微循环，提高新陈代谢水平等，被称为“神秘万能药”，对人类防治疾病，提高健康水平，消除亚健康状态，延长生命和提高生命(生活)质量等功能，但是由于胎盘中可能含有病毒，胎盘可能会对使用者的健康造成危害。因为胎盘在随胎儿离开母体的过程中，很可能会受到多种具有传染性的病毒的污染，艾滋病、梅毒、乙型肝炎等病毒都可以它能够通过胎盘传播，而且有一些病毒在沸水中不能被杀死。因此对胎盘中可能存在的病毒进行灭活具有重要的意义。国内外已研究开发出一些血液病毒灭活技术，如巴斯德液态加热法、有机溶剂，清洁剂法、光敏剂(如亚甲蓝)，光照法和紫外线/补骨脂法。但现有血液制品中病毒灭活技术，大多只能灭活脂包膜病毒等，而对非脂包膜病毒无效。世界上已发现了能在124℃的高温条件下生长的细菌，大量的实验结果表明DNA在100℃的条件下不会断裂。世界上现有的病毒灭活技术的原理，不是特异性地针对病毒核酸，因此对病毒核酸的作用较小。因此，只有加强胎盘筛查与加强灭活病毒相结合，才能达到胎盘使用安全的目的。鉴于目前灭活病毒的方法的局限性、胎盘中可能存在未知病毒、目前病毒灭活效果的评价的不准确性等原因，寻求和开发一种理想的崭新的病毒灭活方法，就具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有问题提供一种人胎盘提取液的病毒灭活方法和由该方法制备的病毒灭活的人胎盘提取液。本专利技术的人胎盘提取液病毒灭活方法中核酸酶与水不溶性大分子固体材料载体结合形成固定化酶，稳定性高，本专利技术的人胎盘提取液病毒灭活方法，高效、高选择性、催化反应条件温和、无污染、低成本、容易操作、酶可以反复利用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术一方面提高一种人胎盘提取液的病毒灭活方法，包括使胎盘提取液与固定化的核酸酶进行酶解反应。其中，所述的核酸酶为牛胰腺核糖核酸酶A。本专利技术另一方面提高一种人胎盘提取液的病毒灭活方法，包括如下顺序进行的步骤：1)采用TrizolRNA抽提试剂提取牛胰腺的总RNA；2)牛胰腺的总RNA的RT-PCR扩增；3)将牛胰腺总RNA的RT-PCR扩增产物克隆到细菌中，制备牛核糖核酸酶A的表达细菌；4)对牛核糖核酸酶A的表达细菌进行诱导处理，然后将细菌破碎细胞产生的核酸酶与水不溶性材料固定，获得固定化牛核糖核酸酶A；5)胎盘提取液病毒与固定化牛核糖核酸A进行酶解反应，而灭活。其中，步骤1)中所述的牛胰腺总RNA按照如下步骤提取得到：A)向牛胰腺组织中加入TrizolRNA抽提试剂，反复吹打牛胰腺组织液体中无细胞团块，制得牛胰腺组织混合物；B)将牛胰腺组织混合物进行匀浆处理，向匀浆液中加入氯仿后进行离心处理，获得第一上清液；C)向第一上清液中加入异丁醇后进行离心处理，获得第二沉积物；D)向第二沉积物中加入乙醇溶液，然后进行离心处理，获得牛胰腺总RNA。特别是，步骤D)中所述乙醇溶液为体积质量百分比浓度为75％的DEPC水溶液，其中，DEPC水溶液的体积质量百分比浓度为1％。其中，步骤2)中所述牛胰腺总RNA的RT-PCR扩增反应包括如下进行的步骤：A)将牛胰腺总RNA与Oligo(dt)15、dNTP、RNasin、M-MLV反转录酶混合，进行逆转录反应，获得逆转录RNA；B)向逆转录RNA中加入MgCl2、dNTP、上游引物、下游引物、cDNA模板、Taq酶和水混合均匀后，进行所述的RT-PCR扩增反应，获得牛胰腺RNA的RT-PCR反应产物。其中，步骤3)中所述牛核糖核酸酶A表达细菌按照如下步骤获得：A)用限制性核酸内切酶EcoRl、限制性核酸内切酶HindⅢ酶水解牛胰腺RNA的RT-PCR反应产物和pET28a质粒，获得牛胰腺RNA的PCR产物DNA片段和pET28a载体DNA片段；B)将T4DNA连接酶加入到牛胰腺RNA的PCR产物DNA片段、pET28a载体DNA片段中，进行连接反应，获得牛胰腺DNA连接物；C)将牛胰腺DNA连接物置于大肠杆菌的培养基中，进行大肠杆菌的培养，获得牛核糖核酸酶A表达细菌。其中，步骤4)中所述固定牛核糖核酸酶A包括如下步骤进行：A)在牛核糖核酸酶A表达细菌的对数生长中期，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，进行诱导处理，获得牛核糖核酸酶A表达细菌细胞；B)牛核糖核酸酶A表达细菌细胞进行超声处理，使细胞破碎后，进行离心处理，收集上清液，获得牛核糖核酸酶A粗酶液；C)将牛核糖核酸酶A粗酶液通过Ni-NTA柱，牛核糖核酸酶A固定于Ni-NTA柱上，获得固定化牛核糖核酸酶A。其中，步骤5)中所述胎盘提取液病毒核酸酶解灭活为使用胎盘提取液与固定化牛核糖核酸酶A接触，胎盘提取液中病毒的核酸被牛核糖核酸酶A酶解而灭活，制得病毒灭活胎盘提取液。其中，所述胎盘提取液病毒灭活方法还包括将固定化牛核糖核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人胎盘提取液的病毒灭活方法，其特征在于，包括使用胎盘提取液与固定化的核酸酶进行酶解反应。/n

【技术特征摘要】
1.一种人胎盘提取液的病毒灭活方法，其特征在于，包括使用胎盘提取液与固定化的核酸酶进行酶解反应。


2.一种人胎盘提取液的病毒灭活方法，其特征在于，包括如下顺序进行的步骤：
1)采用TrizolRNA抽提试剂提取牛胰腺的总RNA；
2)牛胰腺的总RNA的RT-PCR扩增；
3)将牛胰腺总RNA的RT-PCR扩增产物克隆到细菌中，制备牛核糖核酸酶A的表达细菌；
4)对牛核糖核酸酶A的表达细菌进行诱导处理，然后将细菌破碎细胞产生的核酸酶与水不溶性材料固定，获得固定化牛核糖核酸酶A；
5)胎盘提取液病毒与固定化牛核糖核酸A进行酶解反应，而灭活。


3.如权利要求2所述的灭活方法，其特征是，步骤1)中牛胰腺总RNA按照如下步骤提取得到：
A)向牛胰腺组织中加入TrizolRNA抽提试剂反复吹打牛胰腺组织至液体中无细胞团块，制得牛胰腺组织混合物；
B)将牛胰腺组织混合物进行匀浆处理，向匀浆液中加入氯仿，然后进行离心处理，获得第一上清液；
C)向第一上清液中加入异丁醇，然后进行离心处理，获得第二沉积物；
D)向第二沉积物中加入乙醇溶液，然后进行离心处理，获得牛胰腺总RNA。


4.如权利要求3所述的灭活方法，其特征是步骤D)中所述乙醇溶液为体积质量百分比浓度为75％的DEPC水溶液，其中，DEPC水溶液的体积质量百分比浓度为1％。


5.如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是步骤2)中所述牛胰腺总RNA的RT-PCR扩增包括如下进行的步骤：
A)将牛胰腺总RNA与Oligo(dT)15、dNTP、RNasin、M-MLV反转录酶混合，进行逆转录反应，获得逆转录RNA；
B)向逆转录RNA中加入MgCl2、dNTP、上游引物、下游引物、cDNA模板、Taq酶和水混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛龙海，
申请(专利权)人：河北环兴保健食品有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13