【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使用重组T细胞受体基因生成基于细胞的治疗剂的技术相关申请的交叉引用本申请要求于2018年3月1日提交的美国临时专利申请号62/637,240的优先权的权益，该美国临时专利申请的全部内容以引用方式并入本文。美国政府支持本专利技术是在政府支持下在美国国家卫生研究院(TheNationalInstitutesofHealth)授予的GM103418拨款下作出的。政府拥有本专利技术中的某些权利。序列表本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子形式提交，并在此以引用方式整体并入。创建于2019年2月25日的所述ASCII副本名为104434-0179_SL.txt并且大小为206,931字节。
本技术大体上涉及从编码T细胞受体的单个T细胞中高通量分离和操作基因作为细胞疗法的方法、T细胞文库的组合物，以及它们的治疗性应用方法。
技术介绍
提供以下描述以帮助读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献都不被承认是本方法的现有技术。人类有数千种提供适应性免疫系统的主要组分的T细胞受体，并且已证实T细胞受体应答对保护免受包括病毒感染、癌症和自身免疫在内的疾病提供重要贡献。然而，分子定义的T细胞受体疗法对临床护理的影响很窄，因为将T细胞受体应答转化为治疗的方法尚未在实际用于转化疗法的规模上得到充分阐明。现行方法依赖于低通量T细胞受体鉴别技术、克隆T细胞受体的繁琐实践和引导T细胞文库的细胞状态的有限能力。需要建立用于快速转化T细胞受体应答作为用于细胞治疗剂、特别是用...
【技术保护点】
1.一种重组T细胞受体(TCR)文库载体，其包含：/n(a)载体骨架；和/n(b)(i)编码TCRα多肽的第一多核苷酸和编码TCRβ多肽的第二多核苷酸；或/n(ii)编码TCRγ多肽的第一多核苷酸和编码TCRδ多肽的第二多核苷酸；/n其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是关联对，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸来源于从存在于隔室中的单个裂解的T细胞分离的mRNA。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180301 US 62/637,2401.一种重组T细胞受体(TCR)文库载体，其包含：
(a)载体骨架；和
(b)(i)编码TCRα多肽的第一多核苷酸和编码TCRβ多肽的第二多核苷酸；或
(ii)编码TCRγ多肽的第一多核苷酸和编码TCRδ多肽的第二多核苷酸；
其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是关联对，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸来源于从存在于隔室中的单个裂解的T细胞分离的mRNA。
2.根据权利要求1所述的载体，其中使用mRNA捕获试剂或逆转录-PCR(RT-PCR)分离所述单个裂解的T细胞的所述mRNA。
3.根据权利要求2所述的载体，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸可操作地连接，任选地经由接头多核苷酸可操作地连接，并且任选地其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸经由所述T细胞mRNA的逆转录和PCR扩增可操作地连接。
4.根据权利要求1所述的载体，其中已通过在TCR基因中天然发现的靶限制性内切核酸酶位点处切割，将所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸克隆到所述载体骨架中。
5.根据权利要求4所述的载体，其中所述靶限制性内切核酸酶位点以低频率出现在TCR基因中。
6.根据权利要求4所述的载体，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸已被改变以并入表7或8中所公开的至少一个靶限制性内切核酸酶位点。
7.根据权利要求4所述的载体，其中所述靶限制性内切核酸酶位点包含沉默突变。
8.根据权利要求2所述的载体，其中所述mRNA捕获试剂选自由以下组成的组：聚(dT)包被的珠粒、寡核苷酸包被的珠粒、水凝胶珠粒和微阵列孔的表面上的印刷寡聚物。
9.根据权利要求1所述的载体，其中所述隔室是乳液微滴或孔。
10.根据权利要求9所述的载体，其中所述孔位于印刷的聚合物载玻片、塑料板、微量滴定板或凝胶中。
11.根据权利要求1所述的载体，其中所述隔室具有5nL或更小的容积。
12.根据权利要求1所述的载体，其进一步包含至少一种编码表达控制元件的多核苷酸，编码表达控制元件的所述多核苷酸可操作地连接到所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸。
13.根据权利要求12所述的载体，其中所述表达控制元件选自由以下组成的组：启动子、p2A序列和IRES序列。
14.根据权利要求13所述的载体，其中所述启动子是EF1α启动子或CMV启动子。
15.根据权利要求12所述的载体，其中编码所述表达控制元件的所述多核苷酸位于所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸之间。
16.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体被环化。
17.根据权利要求12所述的载体，其中在将所述表达控制元件并入所述载体中之前，所述载体已被环化。
18.根据权利要求12所述的载体，其中在将所述表达控制元件并入所述载体中之后，所述载体已被环化。
19.根据权利要求12所述的载体，其中所述表达控制元件已被并入原型间隔物相邻基序(PAM)附近。
20.根据权利要求12所述的载体，其中已使用选自限制酶或TALEN的DNA修饰酶将所述表达控制元件并入所述载体中。
21.根据权利要求1所述的载体，其进一步包含一种或多种编码转座子的多核苷酸，所述编码转座子的多核苷酸连接到所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸中的至少一种。
22.根据权利要求1所述的载体，其进一步包含编码可检测标志物的多核苷酸。
23.根据权利要求1所述的载体，其进一步包含编码选择标记的多核苷酸。
24.根据权利要求1所述的载体，其进一步包含编码用于控制所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的表达和/或活化的开关机制的多核苷酸。
25.根据权利要求1所述的载体，其进一步包含编码Kozak共有序列或增强子的多核苷酸。
26.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体骨架选自由以下组成的组：逆转录病毒载体骨架、慢病毒载体骨架、腺病毒载体骨架和腺相关病毒载体骨架。
27.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体编码对靶细胞或疾病抗原具有结合特异性的TCR。
28.根据权利要求27所述的载体，其中所述靶细胞是癌细胞或被病毒感染的细胞，任选地其中从受试者分离所述靶细胞。
29.根据权利要求27所述的载体，其中所述疾病抗原是病毒抗原或肿瘤抗原，任选地其中将所述抗原加载到抗原:MHC复合物中。
30.根据权利要求29所述的载体，其中所述疾病抗原是来源于病毒的病毒抗原，所述病毒选自由以下组成的组：腺病毒、CMV、冠状病毒、柯萨奇病毒、登革病毒、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、肠道病毒71(EV71)、埃博拉病毒、甲型肝炎(HAV)、乙型肝炎(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、丙型肝炎(HCV)、丁型肝炎(HDV)、戊型肝炎(HEV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、日本脑炎、白血病病毒、麻疹病毒、触染性软疣病毒、羊痘病毒、细小病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、裂谷热病毒、风疹病毒、轮状病毒、蜱传脑炎病毒(TBEV)、猿免疫缺陷病毒、烟草蚀纹病毒(TEV)、水痘带状疱疹病毒、天花病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒和基孔肯亚病毒。
31.根据权利要求29所述的载体，其中所述疾病抗原是选自由以下组成的组的肿瘤抗原：CD45、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、IGF2B3、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、Meloe、粘蛋白5AC(MUC5AC)、存活素、细胞周期蛋白-A1、MAGE-A1、MAGE-C1、MAGE-C2、SSX2、XAGE1b/GAGED2A、CD19、CD20、CD22、CD52、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TRAILR1)、核因子κ-B配体的受体活化剂(RANKL)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)和癌胚抗原(CEA)。
32.一种重组细胞，其包含根据权利要求1-31中任一项所述的载体，任选地其中所述重组细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞或酵母细胞。
33.一种重组TCR载体文库，其包含多个根据权利要求1-31中任一项所述的载体。
34.根据权利要求33所述的重组TCR载体文库，其中所述多个载体包含TCR库。
35.根据权利要求33所述的重组TCR载体文库，其中所述多个载体中的每个载体已基于以下特征中的一个或多个来选择：TCR克隆普遍性、来自体外测定的TCR富集特征、TCR结合特异性、TCRV区段序列、TCRD区段序列、TCRJ区段序列、TCR基因基序和/或CDR3基因基序。
36.根据权利要求33所述的重组TCR载体文库，其中所述TCR载体文库已通过对所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸进行核酸测序来表征。
37.一种分离的免疫细胞，其包含根据权利要求1-31中任一项所述的载体。
38.根据权利要求37所述的分离的免疫细胞，其中所述免疫细胞是造血干细胞、造血祖细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
39.一种细胞群体，其包含根据权利要求1-31中任一项所述的载体或根据权利要求33到36中任一项所述的载体文库。
40.根据权利要求39所述的细胞群体，其中所述群体包含造血干细胞、造血祖细胞、T细胞和/或NK细胞。
41.一种用于制备重组TCR文库的方法，所述方法包括用根据权利要求33到36中任一项所述的载体文库转化细胞群体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞是造血干细胞、造血祖细胞、T细...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·德科斯基，CY·钟，
申请(专利权)人：堪萨斯大学，
类型：发明
国别省市：美国;US
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