确定体内受体占有率的测定制造技术

本发明专利技术涉及用于监测和测量目的药物与受体结合的测定。在此测定中，将从被给予目的化合物的受试者收集的血液样品与含有淬灭剂的裂解溶液一起孵育。然后从裂解的血液样品分离药物结合和淬灭剂结合的受体。消化所分离的药物结合和淬灭剂结合的受体以产生替代的药物结合和淬灭剂结合的肽。确定替代肽的量。可以通过将药物结合的替代肽的量与药物结合和淬灭剂结合的替代肽的总量进行比较来确定受体占有率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】确定体内受体占有率的测定相关申请的交叉引用本申请要求于2018年5月10日提交的美国临时序列号62/669,442的优先权，将其通过引用以其整体并入本文。
本专利技术涉及直接测量在血液裂解物中共价结合的化合物的实时体内受体占有率的方法。更具体地，本专利技术涉及实时体内BTK受体占有率测量作为药效学生物标记物以用于临床药物开发。
技术介绍
药物发现和开发是一个长期而高风险的过程。由于无数候选药物在早期发现和开发过程中失败，开发成功的新药的平均成本估计高达26亿美元，并且估计进入临床研究的候选药物的总存活率低于12％(PhRMA报告,“BiopharmaceuticalResearch&Development:TheProcessBehindNewMedicines”,2015)。导致这些候选药物失败的主要问题与开发后期期间，特别是概念验证(II期)临床试验期间的临床功效不足或缺乏有关(Kola,I.,等人,J.NatureReviews.DrugDiscovery2004,3,711-715；Arrowsmith,J.,NatureReviews.DrugDiscovery2011,10,87；Morgan,P.,等人,DrugDiscoveryToday2012,17,419-424)。许多正在开发中的小分子药物和生物制剂已被设计来介导免疫系统。这样，这些候选药物通常需要非常低的剂量水平来触发所需的反应。因此，对这些候选药物的药代动力学(PK)和药效学(PD)特性的早期了解对于确定用于临床试验的适当剂量范围至关重要(Topalian,S.L.,等人,TheNewEnglandJournalofMedicine2012,366,2443-2454；Brahmer,J.R.,等人,TheNewEnglandJournalofMedicine2012,366,2455-2465；Tolcher,A.W.,等人,JournalofClinicalOncology:OfficialJournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology2009,27,5800-5807；Hua,F.,等人,JournalofClinicalPharmacology2014,54,14-22；Rutgeerts,P.J.,等人,Gut2013,62,1122-1130)。为了在药物开发阶段期间提高临床效率并降低成本，PD曲线的定量测量与PK曲线对于临床试验的合理设计同样重要。当PD曲线随多个剂量变化时尤其如此。受体占有率(RO)测定测量分子与其受体蛋白(或靶标)的结合，并提供可用于产生PD曲线的定量数据(Liang,M.,等人,CytometryBClinCytom2016,90,117-127)。在临床前动物模型和临床研究中，RO的测量是将功效与机制相关联的关键测定。在实践中，RO在首次人体(FIH)研究中在作出剂量递增决策时特别有用。布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)在经由B细胞受体、Fc受体和RANKL途径的信号转导和激活中起关键作用(Seiler,T.,等人,ExpertOpinInvestigDrugs2017,26,909-915；Whang,J.A.,等人,DrugDiscoveryToday2014,19,1200-1204)。对于基于抗体的药物，通常通过流式细胞术使用与靶分子竞争的抗体测量游离受体和使用非竞争抗体测量总受体来监测RO(Liang,M,等人,CytometryBClinCytom2016,90,117-127；Woska,J.R.,Jr.,等人,Journalofimmunologicalmethods2003,277,101-115)。然而，对于小分子拮抗剂，没有存在用于通过流式细胞术直接检测被占有的受体的抗体试剂。以前，依鲁替尼在外周血单核细胞(PBMC)中的BTKRO是通过以下方式确定的：使用与游离(未被占有的)BTK的活性占有位点结合的荧光亲和探针，然后使用SDS/PAGE和荧光凝胶扫描进行检测(Honigberg,L.A.；J.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2010,107,13075-13080)。基于荧光亲和探针的测定只能确定游离BTK的量，因此，需要一种使用蛋白质印迹的其他测定来测量总BTK。由于临床研究中产生了大量样品，因此使用两个测定平台是不切实际的。另外，所述方法缺乏在未结合测量值与总测量值之间的直接可比性，从而导致较高的测定变化性。最近，已经报道了使用生物素化共价探针的基于ELISA的BTKRO测定，并已用于阿卡卢替尼(acalabrutinib)和CC-292临床研究中(Barf,T.,等人,TheJournalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics2017；Evans,E.K.,等人,TheJournalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics2013,346,219-22)。在这种方法中，在洗掉药物结合的BTK(DB-BTK)时，仅检测游离BTK。使用给药前的样品确定总BTK浓度，其中假定在样品之间的总BTK水平保持一致。可替代地，可以针对游离和总BTK使用分开的基于时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的测定来估计外周血单核细胞(PBMC)中的BTK占有率(Lutz,J.D.N.,等人,华盛顿州贝尔维尤市第七届美国药效学会议(ACoP7)上的海报展示(Posterpresentationatthe7thAmericanConferenceonPharmacometrics(ACoP7)).十月23-26,2016.2016)。然而，在同一样品中游离和总BTK水平是独立测量而不是同时测量的，并且发现总BTK水平在样品之间有显著变化(Honigberg,L.A.,同上)。因此，基于ELISA或TR-FRET的方法受到方法选择导致的固有可变性的限制。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定由于其出色的测定选择性和多路复用能力而在蛋白质定量方面展现出潜力(Neubert,H.,等人,Bioanalysis2014,6,1731-1733)。特别是，结合了免疫捕获富集然后进行LC-MS/MS检测的“杂合”LBA-LC-MS测定已成为强大的技术平台，其以极高的检测选择性来测量蛋白质生物标记物或治疗剂(Stevenson,L.,等人,Bioanalysis2013,5,2903-2918)。LC-MS测定的主要益处是其能够同时定量同一样品中的DB-BTK和游离BTK二者。因此，RO测定对样品或运行变化的敏感度要低得多。然而，LC-MS测定的发展提出了许多挑战。首先，来自被给予药物的动物或人的血液样品可含有过量的药物，这些药物会与游离受体离体反应形成药物结合的受体，从而导致RO的高估。其次，LC-MS/MS通常不如ELISA测定灵敏。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于确定受体占有率的测定方法，所述方法包括以下步骤：/na.从用不可逆地结合受体的目的化合物治疗的受试者收集血液样品，/nb.将含有淬灭剂的裂解溶液添加至所述血液样品，/nc.分离目的受体，/nd.消化所分离的受体以产生替代肽，/ne.测量替代肽的量，并通过将药物结合的替代肽的量与药物结合和淬灭剂结合的替代肽的总量进行比较来确定药物受体占有率。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180510 US 62/669,4421.一种用于确定受体占有率的测定方法，所述方法包括以下步骤：
a.从用不可逆地结合受体的目的化合物治疗的受试者收集血液样品，
b.将含有淬灭剂的裂解溶液添加至所述血液样品，
c.分离目的受体，
d.消化所分离的受体以产生替代肽，
e.测量替代肽的量，并通过将药物结合的替代肽的量与药物结合和淬灭剂结合的替代肽的总量进行比较来确定药物受体占有率。


2.一种用于在被给予共价结合目的受体的目的药物的受试者中确定药物受体占有率的测定方法，所述方法包括以下步骤：
a.从用所述目的药物治疗的受试者收集血液样品
b.添加含有淬灭剂的裂解溶液，所述淬灭剂在与所述目的药物所结合受体部位相同的受体部位不可逆地结合所述血液样品，
c.通过免疫捕获来分离药物结合和淬灭剂结合的受体，
d.消化所分离的药物结合和淬灭剂结合的受体以产生药物结合和淬灭剂结合的替代肽，
e.使用LC-MS/MS测量替代肽的量，并通过将药物结合的替代肽的量与药物结合和淬...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑乃余，I·M·卡特利特，曾加宁，
申请(专利权)人：百时美施贵宝公司，
类型：发明
国别省市：美国;US