神经毒素样毒素及其用途制造技术

本文中提供了在细菌物种屎肠球菌(Enterococcus faecium)中鉴定的新的肉毒梭菌神经毒素(BoNT)同源物(BoNT/EN)。还提供了包含来自BoNT/EN和其他BoNT的结构域的BoNT/EN变体和嵌合毒素。本文中还提供了产生BoNT/EN的方法及其用途(例如在治疗应用中)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】神经毒素样毒素及其用途相关申请本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2017年9月29日提交的并且标题为“NEUROTOXIN-LIKETOXINANDUSESTHEREOF”的美国临时申请No.62/566,171的权益，其全部内容通过引用并入本文。政府支持本公开内容是在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的R01NS080833、R01AI132387的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有某些权利。
技术介绍
肉毒神经毒素(Botulinumneurotoxin，BoNT)是最强效的细菌毒素家族和潜在的生物恐怖剂(bioterrorismagent)。BoNT还已被用于治疗越来越多的医学病症(从肌痉挛到慢性疼痛)以及用于美容应用。随着BoNT的应用不断增长，已报道了多种限制和不良作用。主要的限制是在患者中产生中和抗体，这使得将来的治疗无效。终止使用BoNT常常使患者没有其他有效的方法来治疗/缓解他们的疾病。与BoNT使用相关的不良作用范围从短暂的非严重事件(例如上睑下垂(ptosis)和复视)直到危及生命的事件甚至死亡。BoNT的限制和不良作用在很大程度上与剂量相关。对于开发新的BoNT类型作为治疗性毒素存在相当大的兴趣。在除梭菌(Clostridium)之外的细菌物种中尚未鉴定出BoNT基因簇。
技术实现思路
在一些方面，本文中提供了在屎肠球菌(Enterococcusfaecium)菌株中的质粒上编码的BoNT家族的新成员(称为BoNT/EN)。BoNT/EN切割VAMP1/2/3和数种其他SNARE蛋白(包括SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白(syntaxin)1B和突触融合蛋白4)。提供了具有经修饰接头区的BoNT/EN变体。本文中还提供了嵌合毒素，其包含BoNT/EN的蛋白酶结构域和易位结构域以及来自另外的BoNT(例如，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F或BoNT/G)的受体结合结构域。在一些方面，提供了用于使用新BoNT/EN来治疗疾病的组合物和方法。在另一些方面，提供了产生全长BoNT/EN或嵌合毒素的方法。本公开内容的一些方面涉及分离的屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含与SEQIDNO：1至3中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含SEQIDNO：1至3中任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽由SEQIDNO：1至3中任一种的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽进入细胞。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽切割所述细胞中的SNARE蛋白。在一些实施方案中，SNARE蛋白选自：VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1和突触融合蛋白4。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP1。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN在对应于SEQIDNO：31中A69和D70的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP2。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN在对应于SEQIDNO：32中A67和D68的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP3。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN在对应于SEQIDNO：33中A54和D55的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是SNAP-23。在一些实施方案中，SNARE蛋白是SNAP-25。在一些实施方案中，SNARE蛋白是突触融合蛋白1。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN在对应于SEQIDNO：37中M182和D183的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是突触融合蛋白4。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN在对应于SEQIDNO：38中K191和D192的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，细胞是分泌细胞。在一些实施方案中，细胞是神经元细胞。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽抑制神经元活动(neuronalactivity)。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽诱导松弛性瘫痪(flaccidparalysis)。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是培养的细胞(culturedcell)。在一些实施方案中，细胞是体内的。在一些实施方案中，细胞来自哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是大鼠。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽不与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体交叉反应。本公开内容的另一些方面提供了分离的屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含与SEQIDNO：4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含SEQIDNO：4的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽由SEQIDNO：4的氨基酸序列组成。本公开内容的另一些方面提供了经修饰屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含：(a)蛋白酶结构域；(b)经修饰接头区；以及(c)易位结构域；其中经修饰接头区包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，蛋白酶选自：凝血酶、TEV、PreScission、定位酶(Sortase)、MMP-12、MMP-13、MMP-17、MMP-20、颗粒酶-B、肠激酶、SUMO蛋白酶、LysC和胰蛋白酶。在一些实施方案中，经修饰接头区包含SEQIDNO：41至47中任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰接头来自肉毒梭菌神经毒素。在一些实施方案中，经修饰接头区包含SEQIDNO：48至55的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽还包含受体结合结构域。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽包含与SEQIDNO：5至22中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽包含SEQIDNO：5至22中任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽由SEQIDNO：5至22中任一种的氨基酸序列组成。在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离的屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含与SEQ ID NO：1至3中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170929 US 62/566,1711.分离的屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含与SEQIDNO：1至3中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。


2.权利要求1所述的分离的BoNT/EN多肽，其包含SEQIDNO：1至3中任一种的氨基酸序列。


3.权利要求2所述的分离的BoNT/EN多肽，其由SEQIDNO：1至3中任一种的氨基酸序列组成。


4.权利要求1至3中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN多肽进入细胞。


5.权利要求4所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN多肽切割所述细胞中的SNARE蛋白。


6.权利要求5所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白选自：VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1和突触融合蛋白4。


7.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP1。


8.权利要求7所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN在对应于SEQIDNO：31中A69和D70的氨基酸残基之间切割。


9.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP2。


10.权利要求9所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN在对应于SEQIDNO：32中A67和D68的氨基酸残基之间切割。


11.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP3。


12.权利要求11所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN在对应于SEQIDNO：33中A54和D55的氨基酸残基之间切割。


13.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-23。


14.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-25。


15.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是突触融合蛋白1。


16.权利要求15所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN在对应于SEQIDNO：37中M182和D183的氨基酸残基之间切割。


17.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是突触融合蛋白4。


18.权利要求17所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN在对应于SEQIDNO：38中K191和D192的氨基酸残基之间切割。


19.权利要求4至18中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞是分泌细胞。


20.权利要求19所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞是神经元细胞。


21.权利要求20所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN多肽抑制神经元活动。


22.权利要求20或21所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN多肽诱导松弛性瘫痪。


23.权利要求19所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞是免疫细胞。


24.权利要求4至23中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞是培养的细胞。


25.权利要求4至24中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞是体内的。


26.权利要求4至25中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞来自哺乳动物。


27.权利要求26所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述哺乳动物是人。


28.权利要求26所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述哺乳动物是啮齿动物。


29.权利要求28所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述啮齿动物是小鼠。


30.权利要求28所述的分离的BoNT/EN，其中所述啮齿动物是大鼠。


31.权利要求4至25中任一项所述的分离的BoNT/EN，其中所述细胞是昆虫细胞。


32.权利要求1至31中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN多肽不与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体交叉反应。


33.分离的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含与SEQIDNO：4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。


34.权利要求33所述的分离的BoNT/EN多肽，其包含SEQIDNO：4的氨基酸序列。


35.权利要求34所述的分离的BoNT/EN多肽，其由SEQIDNO：4的氨基酸序列组成。


36.经修饰屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含：
(a)蛋白酶结构域；
(b)经修饰接头区；以及
(c)易位结构域；
其中所述经修饰接头区包含蛋白酶切割位点。


37.权利要求36所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述蛋白酶选自：凝血酶、TEV、PreScission、定位酶、MMP-12、MMP-13、MMP-17、MMP-20、颗粒酶-B、肠激酶、SUMO蛋白酶、LysC和胰蛋白酶。


38.权利要求36所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰接头区包含SEQIDNO：41至47中任一种的氨基酸序列。


39.权利要求36所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰接头来自肉毒梭菌(ClostridiumBotulinum)神经毒素。


40.权利要求39所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰接头区包含SEQIDNO：48至55的氨基酸序列。


41.权利要求36至40中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其还包含受体结合结构域。


42.权利要求36至41中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其包含与SEQIDNO：5至22中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。


43.权利要求42所述的经修饰BoNT/EN多肽，其包含SEQIDNO：5至22中任一种的氨基酸序列。


44.权利要求43所述的经修饰BoNT/EN多肽，其由SEQIDNO：5至22中任一种的氨基酸序列组成。


45.权利要求36至44中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN多肽进入细胞。


46.权利要求45所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN多肽切割所述细胞中的SNARE蛋白。


47.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白选自：VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1和突触融合蛋白4。


48.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP1。


49.权利要求48所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN在对应于SEQIDNO：31中A69和D70的氨基酸残基之间切割。


50.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP2。


51.权利要求50所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN在对应于SEQIDNO：32中A67和D68的氨基酸残基之间切割。


52.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP3。


53.权利要求52所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN在对应于SEQIDNO：33中A54和D55的氨基酸残基之间切割。


54.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-23。


55.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-25。


56.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是突触融合蛋白1B。


57.权利要求56所述的经修饰BoNT多肽，其中所述经修饰BoNT/EN在对应于SEQIDNO：37中M182和D183的氨基酸残基之间切割。


58.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是突触融合蛋白4。


59.权利要求58所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN在对应于SEQIDNO：38中K191和D192的氨基酸残基之间切割。


60.权利要求45至59中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是分泌细胞。


61.权利要求60所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是神经元细胞。


62.权利要求61所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN多肽抑制神经元活动。


63.权利要求62所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN多肽诱导松弛性瘫痪。


64.权利要求60所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是免疫细胞。


65.权利要求45至64中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是培养的细胞。


66.权利要求45至64中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是体内的。


67.权利要求45至66中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞来自哺乳动物。


68.权利要求67所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述哺乳动物是人。


69.权利要求67所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述哺乳动物是啮齿动物。


70.权利要求69所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述啮齿动物是小鼠。


71.权利要求69所述的经修饰BoNT/EN，其中所述啮齿动物是大鼠。


72.权利要求45至66中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是昆虫细胞。


73.权利要求36至72中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN多肽不与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体交叉反应。


74.嵌合神经毒素多肽，其包含：
(a)蛋白酶结构域；
(b)易位结构域；以及
(c)受体结合结构域；
其中所述蛋白酶结构域和所述易位结构域来自屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)，并且其中所述受体结合结构域来自肉毒梭菌神经毒素(BoNT)。


75.权利要求74所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述蛋白酶结构域和所述易位通过接头区连接。


76.权利要求75所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述接头区包含CPNPHFSSQRGLSSC(SEQIDNO：56)的氨基酸序列。


77.权利要求75所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述接头区包含蛋白酶切割位点。


78.权利要求77所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述蛋白酶选自：凝血酶、TEV、PreScission、定位酶、MMP-12、MMP-13、MMP-17、MMP-20、颗粒酶-B、肠激酶、SUMO蛋白酶、LysC和胰蛋白酶。


79.权利要求77或权利要求78所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述接头区包含SEQIDNO：41至47的氨基酸序列。


80.权利要求75所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述接头区来自肉毒梭菌神经毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·斯滕马克，董民，张四才，安德鲁·多克塞，
申请(专利权)人：儿童医学中心公司，保罗·斯滕马克，
类型：发明
国别省市：美国;US