源自基因敲除猪的血液产品及其用途制造技术

提供了一种源自基因敲除猪的血液产品，以及该血液产品的应用。该血液产品与人血清中免疫球蛋白结合降低，对克服超急性免疫排斥反应有作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】源自基因敲除猪的血液产品及其用途
本申请属于基因工程
，具体涉及利用CRISPR/Cas9载体组合获得的源自基因敲除猪的血液产品及其用途。
技术介绍
现代医学不断进步，输血在临床上被大量使用，但同样面临越来越多的问题，包括艾滋病、乙肝、丙肝等高发的传染病导致严重的输血风险。血液需求不断增多而献血量相对减少，血源资源日渐紧张。可以用动物红细胞(RBCs)研发出人RBCs输血的替代品。猪红细胞(pRBCs)已广泛用于异种输血红细胞的研发，pRBCs和人RBCs具有大量的相似性。同时，饲养在无特定病原体和生物安全条件下，pRBCs不携带人类的病原微生物。pRBCs不表达MHC抗原，即猪白细胞抗原(SLA)，因此降低了免疫原性。pRBCs没有细胞核，也不可能携带猪内源性逆转录病毒。但是直接将野生型pRBCs用于临床输血还会导致很多问题。将野生型pRBCs输注到灵长类动物体中会产生一致的超急性排斥反应。例如，由于野生型pRBCs表达了人类具有天然溶血抗体的Gal和非Gal抗原，能够通过抗体-抗原结合和/或补体激活直接导致血细胞的裂解。因此目前亟待获得改造的能够直接用于人输血的pRBCs。
技术实现思路
本申请提供源自基因敲除猪的血液产品，以及所述血液产品的应用。本申请的所述血液产品具备以下性质中的至少一个：1)与人血清中免疫球蛋白结合显著降低；2)对克服超急性免疫排斥反应有显著作用；3)有效解决了临床缺血的问题；4)为临床输血提供宝贵的材料来源；5)有效敲除了猪的GGTA1基因；6)有效敲除了猪的CMAH基因；7)有效敲除了猪的β4GalNT2基因；8)适于大规模批量生产；9)能够有效进行质量管控；和/或，10)安全可靠，不携带病原微生物和/或病毒。本申请令人惊奇地发现，通过将待敲除基因中合适的外显子进行敲除，例如，通过针对待敲除基因的特定外显子设计合适的靶向的SgRNA序列，可以借助CRISPR/Cas9载体组合显著提高对所述待敲除基因(例如，包含GGTA1基因、CMAH基因和/或β4GalNT2基因)的敲除效率。进而得到源自该基因敲除猪的血液产品，从而有效降低异种移植所带来了超急性免疫排斥反应，使其可以作为一种人血的替代产品，发挥多种的试验和临床功能。一方面，本申请提供了一种源自基因敲除猪的血液产品，所述基因敲除猪的GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因被敲除，其中所述β4GalNT2基因中编码8号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述β4GalNT2基因被敲除。在某些实施方式中，所述GGTA1基因中编码3号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述GGTA1基因被敲除。在某些实施方式中，所述CMAH基因中编码6号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述CMAH基因被敲除。在某些实施方式中，所述基因敲除猪通过使用CRISPR/Cas9载体组合制备。在某些实施方式中，所述GGTA1基因的3号外显子、所述CMAH基因的6号外显子以及所述β4GalNT2基因的8号外显子作为CRISPR/Cas9所靶向的部分。在某些实施方式中，所述CRISPR/Cas9载体组合包括GGTA1-CRISPR/Cas9载体、CMAH-CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体，所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体含有SEQIDNo:1所示的特异性靶向GGTA1基因的SgRNA核苷酸序列，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体含有SEQIDNo:2所示的特异性靶向CMAH基因的SgRNA核苷酸序列，且所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体含有SEQIDNo:3所示的特异性靶向β4GalNT2基因的SgRNA核苷酸序列。在某些实施方式中，所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体包含SEQIDNo:4所示的核苷酸序列，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体包含SEQIDNo:5所示的核苷酸序列，且所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体包含SEQIDNo:6所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述血液产品中包含所述基因敲除猪的红细胞。在某些实施方式中，所述血液产品中包含所述基因敲除猪的外周血单核细胞(PBMC)。在某些实施方式中，所述红细胞具有降低的aGal抗原水平、降低的Neu5Gc抗原水平和降低的Sda样抗原水平。在某些实施方式中，所述PBMC具有降低的aGal抗原水平、降低的Neu5Gc抗原水平和降低的Sda样抗原水平。在某些实施方式中，与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞与人免疫球蛋白的结合水平降低。在某些实施方式中，与源自野生型猪的PBMC相比，所述基因敲除猪的PBMC与人免疫球蛋白的结合水平降低。在某些实施方式中，与源自人的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞与人免疫球蛋白的结合水平相当。在某些实施方式中，与源自人的PBMC相比，所述基因敲除猪的PBMC与人免疫球蛋白的结合水平相当。在某些实施方式中，所述人免疫球蛋白包括人IgG和/或人IgM。在某些实施方式中，与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞与人血清的凝集反应降低。在某些实施方式中，所述凝集反应由抗血型抗原的IgM抗体和/或抗血型抗原的IgG抗体引起。在某些实施方式中，与源自野生型猪的红细胞相比，所述基因敲除猪的红细胞被输入人体后发生溶血性输血反应的可能性降低。另一方面，本申请提供所述的血液产品用于制备向人输注的血液制品的用途。在某些实施方式中，所述向人输注的血液制品基本不引起和/或能够改善超急性免疫排斥反应。本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及专利技术的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。具体实施方式在本申请中，术语“基因敲除”通常是指使基因沉默和/或无法表达出其编码的蛋白质的基因工程手段。例如，所述基因敲除可以使用CRISPR/Cas系统。在本申请中，术语“GGTA1基因”通常是指编码α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)的基因。在本申请中，猪(Susscrofa)的GGTA1基因在Ensemble的登录号为ENSSSCG00000005518。猪的GGTA1假基因(pseudogene)的GenBank登录号为396733。在本申请中，术语“CMAH基因”通常是指编码单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidinemonophospho-N-acetylneuraminicacidhydroxylase，CMAH)的基因。在本申请中，猪(本文档来自技高网...

【技术保护点】
源自基因敲除猪的血液产品，所述基因敲除猪的GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因被敲除，其中所述β4GalNT2基因中编码8号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述β4GalNT2基因被敲除。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180507 CN 2018104260186源自基因敲除猪的血液产品，所述基因敲除猪的GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因被敲除，其中所述β4GalNT2基因中编码8号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述β4GalNT2基因被敲除。


根据权利要求1所述的血液产品，其中所述GGTA1基因中编码3号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述GGTA1基因被敲除。


根据权利要求1-2中任一项所述的血液产品，其中所述CMAH基因中编码6号外显子中一个或多个氨基酸的一个或多个核苷酸缺失，从而使得所述CMAH基因被敲除。


根据权利要求1-3中任一项所述的血液产品，其中所述基因敲除猪通过使用CRISPR/Cas9载体组合制备。


根据权利要求4所述的血液产品，其中所述GGTA1基因的3号外显子、所述CMAH基因的6号外显子以及所述β4GalNT2基因的8号外显子作为CRISPR/Cas9所靶向的部分。


根据权利要求4-5中任一项所述的血液产品，其中所述CRISPR/Cas9载体组合包括GGTA1-CRISPR/Cas9载体、CMAH-CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体，所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体含有SEQIDNo：1所示的特异性靶向GGTA1基因的SgRNA核苷酸序列，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体含有SEQIDNo：2所示的特异性靶向CMAH基因的SgRNA核苷酸序列，且所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体含有SEQIDNo：3所示的特异性靶向β4GalNT2基因的SgRNA核苷酸序列。


根据权利要求6所述的血液产品，其中所述GGTA1-CRISPR/Cas9载体包含SEQIDNo：4所示的核苷酸序列，所述CMAH-CRISPR/Cas9载体包含SEQIDNo：5所示的核苷酸序列，且所述β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体包含SEQIDNo：6所示的核苷酸序列。

【专利技术属性】
技术研发人员：戴一凡，杨海元，王盈，
申请(专利权)人：创观苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32