利用烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s提高烟草叶片数与生物量的方法技术

技术编号:26752984 阅读:26 留言:0更新日期:2020-12-18 21:20
利用烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s提高烟草叶片数与生物量的方法,所述烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示,方法是先构建植物RNAi载体。然后鉴定农杆菌介导的烟草转化及转基因植株,之后提取野生型植株和25株转pHellsgate12的RNA基因T0代植株的总RNA,进行Real time‑PCR分析,内参基因为26s,分析不同株系的表达情况,选取表达量最低的2株植株。本发明专利技术中,在烟草植株内抑制烟草内源基因NtCYP94B3s的表达会使烟草叶片数及生物量明显提高。该方法具有广阔的应用前景,经济效益潜力巨大。

【技术实现步骤摘要】
利用烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s提高烟草叶片数与生物量的方法
本专利技术属于遗传工程
,具体涉及一种烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s应用。
技术介绍
烟草是重要的经济作物,烟草中含生物碱约1%~9%及芸香苷、有机酸、脂肪、树脂、蛋白质、糖、香料等物质。在化工、农药和医药等领域有十分广泛的用途。烟草具有很强的生理活性,我国传统医药有许多利用烟草治病的记载。现代科技对烟草的研究已取得许多成果。烟碱可用适当的方法和剂量制成戒烟制剂,如无烟的烟草、尼古丁口香糖、尼古丁贴剂、尼古丁喷雾剂等。在疾病防治方面,利用烟碱对中枢神经系统的广泛作用,通过对脑内神经元烟碱受体亚型结构和功能的鉴别,利用烟碱受体亚型激动剂和拮抗剂的有利作用,为某些中枢疾病防治开辟了一条新途径。烟碱可制成植物源杀虫剂,是防治蔬菜害虫的理想药剂,对各类害虫触杀、熏蒸或胃毒效果都很好,由于是天然物质,最大特点是没有残毒,不造成二次污染,不产生耐药性,是保护生态环境的生物活性农药。转基因烟草可作为生物反应器生产药物,全球有六家生物技术公司利用不同的技术路线将人类基因导入烟草中,以使烟草生产出人类需要的蛋白质、抗体和酶。烟草中的蛋白质可提取加工成食用和工业用蛋白质,烟草中的香料物质可以作为食品添加剂。烟草的经济价值主要体现在烟叶部分,烟叶的产量决定了烟农的收益。而烟叶产量主要取决于叶片数量及生物量多少。叶片数多并且株型较好则单位种植面积烟叶的产量越高。目前提高烟草叶片数与生物量的方法主要还是通过常规育种筛选具有优良株型及叶片的品种,常规育种筛选手段主要是通过品种与资源的反复杂交,回交最终获得优异的品种,但其存在育种周期较长,而且资源狭窄的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种育种周期短、易于扩展资源的利用烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s提高烟草叶片数与生物量的方法。本专利技术采取的技术方案如下:利用烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s提高烟草叶片数与生物量的方法,其特征在于,所述的烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示,氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示,方法如下:(1)构建植物RNAi载体:以Nicotianaattenuata的cDNA为模板,用含有gateway接头序列的引物进行PCR扩增,扩增产物经PCR产物纯化后,经过BP反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体中,将构件好的BP反应载体通过LR反应将NtCYP94B3s片段置换到PHellsgate12RNAi干扰载体中;所述gateway反应引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4;(2)鉴定农杆菌介导的烟草转化及转基因植株:先采用冻融法转化农杆菌,再用叶盘法转化烟草Nicotianaattenuata,得到稳定的转基因株系,采用Qiagen公司DNA提取试剂盒,提取转基因株系幼苗的基因组DNA,设计Kan抗性基因引物进行PCR扩增,筛选阳性植株,检测到25株阳性植株;所述Kan抗性基因引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:5和SEQIDNO:6;(3)提取野生型植株和25株转pHellsgate12的RNA基因T0代植株的总RNA,进行Realtime-PCR分析,内参基因为26s,分析不同株系的表达情况,选取表达量最低的2株植株。进一步地,所述的烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s的核苷酸序列为与序列表SEQIDNo:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列,或者与序列表SEQIDNo:1限定的DNA序列具有70%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本专利技术通过在烟草植株体内抑制所述NtCYP94B3s基因的表达,可明显提高烟草中JA及JA-IIe的含量,从而提高烟草叶片数与生物量,具有广阔的应用前景,经济效益潜力巨大。附图说明图1为NtCYP94B3s基因的RNAi片段PCR产物电泳图;其中,M-分子量标记;1-PCR产物;图2为中间载体Pdonr-zeo图;图3为NtCYP94B3s基因植物RNAi干扰载体pHellsgate12图;图4为NtCYP94B3s基因RNAi干扰烟草植株的JA及JA-IIe含量示意图;其中,Nicotianaattenuata对照;NtCYP94B3s-7和NtCYP94B3s-22为转基因烟株。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明,但不以任何方式对本专利技术加以限制,基于本专利技术教导所作的任何变换或替换,均属于本专利技术的保护范围。利用烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s提高烟草叶片数与生物量的方法,其特征在于,所述的烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示,或者与序列表SEQIDNo:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列,或者与序列表SEQIDNo:1限定的DNA序列具有70%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。所述烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。本专利技术方法是在烟草植株体内抑制所述NtCYP94B3s基因的表达,可提高烟草JA含量,进而提高烟草叶片数与生物量。可通过由RNA介导的多种方法抑制NtCYP94B3s基因的表达,如:植物病毒载体介导基因沉默的方法、农杆菌介导转化RNAi干扰载体、优化修改基因编码匡、优化基因启动子等方法,但并不限于上述几种方法,只要能抑制NtCYP94B3s表达即可。下面的实施例中所有的植物组织材料取自渐狭叶烟草。烟草植株的生长和发育阶段都是在人工气候室中,并保持生长温度在22-25℃之间,以尽量减少外界环境因素的影响。实验选取的烟草材料为6-7叶期,发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株。采取非转基因烟株及转基因烟株的相同叶位叶片进行采样,将这些烟草材料测定JA(茉莉酸)含量。本专利技术方法具体如下:1、植物RNAi载体的构建以Nicotianaattenuata的cDNA为模板,用含有gateway接头序列的引物进行PCR扩增(图1),扩增产物经PCR产物纯化后,经过BP反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体(见图2)中,将构件好的BP反应载体通过LR反应将NtCYP94B3s片段置换到PHellsgate12RNAi干扰载体(见图3)中。(1)gateway反应引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4,具体如下:SEQIDNO:33NtCYP94B3s_F5’-AAAAAGCAGGCTCGATGGAACACACAGCGCAAATT-3’;SEQIDNO:4NtCYP94B3s_R5’-AGAAAGCTGGGGATCTCGTTAATACAACAGTGAACACG-3’。(2)PCR反应均采用Phusion高保本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.利用烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s提高烟草叶片数与生物量的方法,其特征在于,所述的烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示,氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示,方法如下:/n(1)构建植物RNAi载体:以Nicotiana attenuata的cDNA为模板,用含有gateway接头序列的引物进行PCR扩增,扩增产物经PCR产物纯化后,经过BP反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体中,将构件好的BP反应载体通过LR反应将NtCYP94B3s片段置换到PHellsgate12 RNAi干扰载体中,所述gateway反应引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;/n(2)鉴定农杆菌介导的烟草转化及转基因植株:先采用冻融法转化农杆菌,再用叶盘法转化烟草Nicotiana attenuata,得到稳定的转基因株系,采用Qiagen公司DNA提取试剂盒,提取转基因株系幼苗的基因组DNA,设计Kan抗性基因引物进行PCR扩增,筛选阳性植株,检测到25株阳性植株;所述Kan抗性基因引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6;/n(3)提取野生型植株和25株转pHellsgate12的RNA基因T0代植株的总RNA,进行Realtime-PCR分析,内参基因为26s,分析不同株系的表达情况,选取表达量最低的2株植株。/n...

【技术特征摘要】
1.利用烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s提高烟草叶片数与生物量的方法,其特征在于,所述的烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示,氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示,方法如下:
(1)构建植物RNAi载体:以Nicotianaattenuata的cDNA为模板,用含有gateway接头序列的引物进行PCR扩增,扩增产物经PCR产物纯化后,经过BP反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体中,将构件好的BP反应载体通过LR反应将NtCYP94B3s片段置换到PHellsgate12RNAi干扰载体中,所述gateway反应引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4;
(2)鉴定农杆菌介导的烟草转化及转基因植株:先采用冻融法转化农杆菌,再用叶盘法转化烟草Nicotianaattenuata,得...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨大海王蕾杨飞汤金香白戈李勇逄涛姚恒谢贺陈学军肖炳光费明亮张谊寒
申请(专利权)人:云南省烟草农业科学研究院
类型:发明
国别省市:云南;53

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