癌症治疗反应分析制造技术

应用纳米免疫测定(NIA)定量来自组织样品的少量裂解物中的分析物，包括但不限于涉及致癌或代谢信号通路的蛋白和亚型蛋白。NIA的目的样品包括但不限于血液或实体瘤显微活检样品，例如细针抽吸物(FNA)或循环肿瘤细胞。可以在单个时间点或多个时间点采样。样品可以是小至100000个、5000个、1000个、100个、50个、25个或更少的细胞。NIA的检测方法在微流体系统中结合了蛋白质(分子)大小分离或蛋白质等电聚焦，以及抗体检测。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】癌症治疗反应分析交叉引用本专利申请案主张于2018年10月2日提交的编号为62/740,013的美国临时专利申请案以及于2018年3月16日提交的编号为62/644,303的美国临时专利申请案提交日期的优先权，上述专利中的内容以引用方式并入本文中。联邦资助的研究与开发本专利技术专利获得了政府的支持，其中，美国国立卫生研究院的资助项目为CA196585。政府拥有本专利技术的某些权利。
技术介绍
肿瘤细胞的转化和生长是一个复杂的过程，即使在特定的组织类型内也可以变化。可以定义肿瘤细胞表型的分析方法可用于确定适当的疗法，因此具有临床意义。另外，了解起效疗法相关的机制可以确定这些药剂的最佳配方和剂量；可以筛选有效治疗癌症的药剂；以及在治疗过程中进行患者随访。蛋白质表达和翻译后修饰的各种变化发生在肿瘤形成和治疗反应过程中，例如可以传递细胞内信号的分子机制，即可逆磷酸化。大量信号蛋白是作用于丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸残基的激酶或磷酸酶。预计有超过2000种人类基因编码激酶，并且每种激酶都有可能作用于多个靶点，因此信号网络非常复杂。解决这种复杂性的关键是开发新的蛋白质组学技术，以多重方式定量监测信号蛋白质的磷酸化状态。该技术使我们能够在全球范围内详细分析信号通路，并且快速识别对治疗剂有反应、而先前未认可的信号转导机制。蛋白质检测中的敏化方法可以追踪对治疗剂反应的蛋白质，特别是亚型蛋白质的变化，具有很大的临床意义。本专利技术解决了这一需求。
技术实现思路
在特定实施例中，应用纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)定量来自组织样品的少量裂解物中的分析物，包括但不限于蛋白质数量、亚型蛋白质、参与致癌信号通路的蛋白质磷酸化亚型。NIA的目的样品包括但不限于血液及其衍生物，例如来自血液的血浆或细胞，或实体瘤显微活检样品，例如细针抽吸物(FNA)或循环肿瘤细胞。可以在单个时间点或多个时间点采样。样品可以是小至100000个、5000个、1000个、100个、50个、25个或更少的细胞。NIA的检测方法在纳米流体系统中结合了(分子)大小或蛋白质等电聚焦，以及抗体检测。样品中可以保留血细胞以减少变异性。由于NIA只需要少量标本，因此该分析是微创的，这使得在治疗开始之前和之后能获得诸如系列蛋白质谱，以及通过量化收治患者中蛋白质活性的早期变化来确定预测性蛋白质生物标志物；等等。在一些实施例中，通过细针抽吸获得临床样品。在一些实施例中，临床样品是在体内取样或离体培养的实体瘤的细针抽吸物(FNA)。在一些实施例中，该方法还比较了FNA与相邻的癌旁组织。在一些实施例中，对象是人类。在本专利技术的一些实施例中，NIA检测温度维持在高达约25℃，例如4℃至约25℃的样品。磷酸化蛋白质稳定性，例如临床细针抽吸物(FNA)样品中的ERK磷酸化，的一个重要问题是，FNA的储存时间是指在实验室中收集FNA的时间间隔还是快速冷冻FNA(例如在-80℃或更低的温度下)的时间间隔。FNA储存时间可长达12、18、24、36、48小时或更长时间；也可短至4、6、8、12小时。FNA可以储存在冷介质中，例如RPMI、DME、PBS等，储存温度约4℃至约10℃之间，通常为4℃。为了解决这些问题，我们进行了基准测试，以验证肾癌患者FNA中蛋白质磷酸化的稳定性。ERK的磷酸化和非磷酸化亚型的相对丰度非常稳定，表明FNA处理的方法没有显著改变测量值，即使储存时间长达2天。在一些实施例中，临床样品在FNA储存时间后快速冷冻。用于分析的蛋白质包括但不限于谷氨酰胺酶1(GLS1)的亚型KGA和GAC；过氧化物酶6(PRDX6)；人碳酸酐酶9；人α微管蛋白；人细胞周期蛋白D1；人p21；人p27；人视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)；人受体酪氨酸激酶AXL；人血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；人PAX8；人PDL1。分析可以针对表达水平和/或亚型分布。在一些实施例中，NIA用于监测癌细胞样品(例如患者样品)对治疗的反应。在一些实施例中，疗法为放射治疗。在一些实施例中，疗法为靶向治疗，例如激酶抑制剂。此处举例说明的特定药物包括，例如卡博替尼、阿西替尼、曲美替尼、rigosertib、IQGAP1、WW结构域肽等。放射和/或免疫疗法可以与任何全身疗法结合。治疗后通过NIA分析样品以确定目的蛋白质，包括亚型蛋白质，的丰度和分布。尤其是，药物治疗导致NIA可检测的亚型蛋白质(包括ERK、AKT1、AKT3、MEK2、PRDX6、p70S6K1、S6、PCNA、细胞周期蛋白D1、裂解PARP-1)的差异分布，其在处理和未处理的样品中有不同的分布模式。在一些实施例中，用药物治疗患者，并在治疗后获得活检样品。在其他实施例中，离体处理活检样品以确定癌症对目的治疗的响应性，其中如果证明单个样品具有响应性，则可以向患者施用治疗。附图说明图1A-1B.图1A:两个人类RCC肿瘤(T1和T2)和一个正常肾(N)中ERK2磷酸化亚型的相对丰度(通过使用抗ERK2抗体[EMDMillipore，目录号06-182]以1:300稀释度的电荷分离NIA测量，取两次实验的平均值)，比较同一天(组织收集后1小时内，“第0天”)与24小时之后(“第1天”)的FNA处理。图1B：同一人RCC肿瘤的两个区域(T1和T2)和相邻正常肾(N)中ERK2磷酸化亚型的相对丰度(通过NIA测量，取两次实验的平均值)，比较组织收集当天(组织收集后1小时内，“第0天”)与2天后(收集后40小时，“第2天”)的FNA处理。图2.通过使用抗ERK2抗体[EMDMillipore，目录号06-182]以1:300稀释度的电荷分离NIA测量ERK2磷酸化亚型的相对丰度，在同一人RCC肿瘤的两个区域(区域T1，左图；区域T2，右图)，比较室温下与冰上的FNA运输和处理。收集后1小时内处理FNA。图3.从4例肾癌患者获取RCC肿瘤的两个区域(T1和T2)和相邻肾组织(N)的细针抽吸物。电荷分离NIA用于测量这些样品中谷氨酰胺酶1(GLS1)的亚型KGA和GAC水平，以抗GLS1(Epitomics，目录号T3472)为抗体。左：来自FNA的NIA谷氨酰胺酶迹线的例证。右：4例患者的图形数据，每例患者有2个来自肿瘤的FNA(T1和T2)，以及来自癌旁组织(N)的一个FNA。图4.使用Mag-Sifter技术从10例患者中分离循环肿瘤细胞：冷冻每位患者的细胞沉淀。使用电荷分离NIA分析每位患者的细胞沉淀，以测量过氧化物酶6(PRDX6)亚型，用抗PRDX6为抗体(Abcam，目录号73350)。患者有EGFR突变(MUT)，野生型(WT)或未知的EGFR状态(A，B，C，D)。图5A:通过人碳酸酐酶9(CA9)和人α-tublin(微管蛋白)的大小分离进行纳米免疫测定(NIA)。在全细胞蛋白裂解物的NIA大小分离后，用抗CA9(GeneTex，克隆GT12，目录号GTX70020)或抗微管蛋白抗体(EMDMillipore，克隆DM1A，目录号MABT205)在指定稀释度下探测缺乏vonHip本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种监测对癌症治疗反应的方法，该方法包括；/n用目的疗法治疗个体的癌细胞；/n对处理过的癌细胞样品进行纳米免疫测定(NIA)；/n确定目的蛋白质的分布模式；/n比较蛋白质分布模式与参考蛋白质的分布模式以确定癌细胞是否对治疗有反应。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180316 US 62/644,303;20181002 US 62/740,0131.一种监测对癌症治疗反应的方法，该方法包括；
用目的疗法治疗个体的癌细胞；
对处理过的癌细胞样品进行纳米免疫测定(NIA)；
确定目的蛋白质的分布模式；
比较蛋白质分布模式与参考蛋白质的分布模式以确定癌细胞是否对治疗有反应。


2.根据权利要求1的方法，还包括，根据响应性测定来治疗个体。


3.根据权利要求1或2的方法，其中癌细胞在体内处理。


4.根据权利要求1或2的方法，其中癌细胞为体外处理的活检样品。


5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中处理过的癌细胞样品是血液样品。


6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中处理过的癌细胞样品是血液样品。


7.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中处理过的癌细胞样品是细针抽吸物。


8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中参考蛋白质分布...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿文·古乌，爱丽丝·凡，迪恩·W·费尔舍，
申请(专利权)人：小利兰·斯坦福大学托管委员会，
类型：发明
国别省市：美国;US