一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法，包括：步骤一、子宫内膜干细胞的提取与培养，得到子宫内膜干细胞；步骤二、间充质干细胞的提取与培养，得到间充质干细胞；步骤三、温敏性壳聚糖水凝胶的制备；步骤四、细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备。本发明专利技术还公开了细胞复合型子宫内膜修复凝胶作为治疗宫腔粘连的应用。本发明专利技术具有以下有益效果：1、自体干细胞移植，基本没有排斥风险；2、自体子宫内膜干细胞和间充质干细胞复合移植，加快了内膜、微小血管和间质的再生，子宫内膜修复时间明显缩短；3、温敏凝胶可局部注射后成形，既可为干细胞提供三维存留空间，又可以防止再生粘膜的粘连。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法及应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法及应用。
技术介绍
根据文献报道，人工流产术、刮宫术所致的宫腔粘连发生率高达25％-30％，且术后再粘连发生率很高，尤其是重度宫腔粘连，术后再粘连率高达62.5％。如何能彻底治愈宫腔粘连是临床的棘手问题。近年来，国内外学者提出，宫腔粘连的发生与子宫内膜干细胞损伤相关，内膜损伤导致内膜干细胞减少或功能受损，子宫内膜无法完全再生，导致内膜瘢痕修复，最终导致宫腔粘连的发生。子宫内膜干细胞作为一种成体干细胞具有容易分离和扩增的特性，有更强的集落形成能力和更少的提取技术问题，拥有巨大的自体治疗潜力。而脐带本身为一种医疗垃圾，脐带间充质干细胞有很强的增殖分化能力，并且免疫原性低，对于局部微环境有改善及调理作用。目前对于宫腔粘连的治疗手段普遍存在临床治疗效果不佳，现有细胞移植出现排斥、细胞修复时间不足、术后再粘连等问题。因此，本专利技术公开了一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶，能够很好的解决上述问题。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一、子宫内膜干细胞的提取与培养，得到子宫内膜干细胞；/n步骤二、间充质干细胞的提取与培养，得到间充质干细胞；/n步骤三、温敏性壳聚糖水凝胶的制备；/n步骤四、细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、子宫内膜干细胞的提取与培养，得到子宫内膜干细胞；
步骤二、间充质干细胞的提取与培养，得到间充质干细胞；
步骤三、温敏性壳聚糖水凝胶的制备；
步骤四、细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备。


2.如权利要求1所述的一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤一包括以下步骤：
(1)、无菌条件下，取子宫内膜组织，用无Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液冲洗至少三次，然后转入无菌培养皿中，并将其剪至体积小于1mm3的小块；
(2)、向步骤(1)的无菌培养皿中加入1.5～3倍体积的0.1v/v％胶原酶水溶液，在37℃下，水浴振荡消化30～80min，收集消化液于离心管中，向离心管中加入DMEM/F12完全培养基终止消化，然后1000rpm离心10min，弃去上清，保留细胞沉淀；
(3)、向离心管中加4～8倍体积的红细胞裂解液，持续震荡，直到离心管内液体逐渐变为红色时，向离心管中添加10mlPBS缓冲液，再次1000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀；
(4)、用PBS缓冲液洗涤上述细胞沉淀沉淀至少2次，弃上清，保留细胞沉淀；
(5)、用4倍体积的DMEM/F12完全培养基重悬步骤(4)保留的细胞沉淀，制备细胞悬液；
(6)、将细胞悬液依次过200目及400目网筛并用DMEM/F12完全培养基冲洗细胞网，收集400目下的细胞悬液，以1000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀；
(7)、向步骤(6)保留的细胞沉淀中加入DMEM/F12完全培养基重悬上述细胞沉淀，并转移到细胞培养瓶中，在37℃、5v/v％CO2培养箱中进行培养，于培养24～48h后首次用DMEM/F12完全培养基进行半量换液，以后每2-3天用DMEM/F12完全培养基进行一次全量换液，弃去未贴壁细胞，待原代细胞生长融合达80％-90％时，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰酶水溶液进行传代，并以6×103个细胞/cm2的密度进行传代培养,传到三代及三代以上,得到子宫内膜干细胞，其中：
步骤(2)、步骤(5)、步骤(6)、步骤(7)中的DMEM/F12完全培养基含10v/v％FBS和1v/v％青链霉素，余量为DMEM/F12。


3.如权利要求2所述的一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法，其特征在于，对于步骤一得到的子宫内膜干细胞进行鉴定，鉴定合格后才能作为制备细胞复合型子宫内膜修复凝胶的原料，对于子宫内膜干细胞的鉴定包括子宫内膜干细胞表面标记物的鉴定、成骨分化的鉴定和成脂分化的鉴定，其中：
(a)、子宫内膜干细胞表面标记物的鉴定，包括以下步骤：
(a1)、取步骤(7)得到的融合度为90％～95％的第3代子宫内膜干细胞，弃掉培养基，加入PBS缓冲液清洗两遍，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰酶进行消化，待细胞大多变圆浮起时，加入等体积的DMEM/F12完全培养基终止消化，得到细胞悬液；
(a2)、将步骤(a1)得到的细胞悬液转移到离心管中，以1000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀；
(a3)、将步骤(a2)得到的细胞沉淀用PBS缓冲液清洗2遍，以1000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀；
(a4)、用PBS缓冲液重悬步骤(a3)得到的细胞沉淀得到细胞悬液，并进行计数；
(a5)、调节步骤(a5)得到的细胞悬液的细胞浓度为2×106个/ml，然后取5个流式管，每管加入100ul细胞悬液，吹打混匀；
(a6)、将5个流式管分别加入10ul带有FITC或PE荧光标记的一抗，一抗分别为FITC同型抗体、PE同型抗体、CD29抗体、CD73抗体、CD90抗体、CD34抗体、CD45抗体、CD133抗体，在室温避光条件下孵育20-30min；
(a7)、孵育结束后，每管加入100ulPBS缓冲液轻轻吹打至单细胞悬液后，通过流式细胞仪检测其表面标记物荧光强度，子宫内膜干细胞显示CD29抗体、CD73抗体和CD90抗体阳性，CD34抗体、CD45抗体和CD133抗体阴性；
(b)、子宫内膜干细胞诱导成骨分化能力的鉴定
(b1)、取步骤(7)得到的融合度为90％～95％的第3代子宫内膜干细胞，弃掉培养基，加入PBS缓冲液清洗两遍，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰酶进行消化，待细胞大多变圆浮起时，加入等体积的DMEM/F12完全培养基终止消化，得到细胞悬液；
(b2)、将步骤(b1)得到的细胞悬液转移到离心管中，以1000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀；
(b3)、将步骤(b2)得到的细胞沉淀用PBS缓冲液清洗2遍，以1000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀；
(b4)、用PBS缓冲液重悬步骤(b3)得到的细胞沉淀，得到细胞悬液并进行计数，
(b5)、调节步骤(b4)得到的细胞悬液的细胞浓度为2×106个/ml，在铺有明胶的6孔板中各加入100ul细胞悬液，再补充2mlDMEM/F12完全培养基进行细胞培养；
(b6)、待细胞融合度为60％-70％时，更换培养基为预热至37℃的含10％FBS的成人脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养基，每隔3天换液一次，诱导2-4周；
(b7)、诱导结束后，弃培养基，用PBS缓冲液清洗2遍，4％多聚甲醛固定30min，吸去多聚甲醛溶液，用PBS缓冲液洗脱固定液2次，每次5min；
(b8)、每孔加入1ml茜素红工作液,室温染色5min，用PBS缓冲液洗脱染色液，显微镜下观察成骨染色情况，成骨分化的子宫内膜干细胞内呈现深浅不同的红色矿化结节；其中：
成人脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养基为：成人脂肪间质干细胞成骨诱导分化基础培养基175ml、成人脂肪间质干细胞成骨诱导分化培养基专用血清20ml、双抗2ml、谷氨酰胺2ml、抗坏血酸400ul、β-甘油磷酸钠2ml、地塞米松20ul；
(c)、子宫内膜干细胞成脂分化的鉴定
(c1)、取步骤(7)得到的融合度为90％～95％的第3代、子宫内膜干细胞，弃掉培养基，加入PBS缓冲液清洗两遍，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰酶进行消化，待细胞大多变圆浮起时，加入等体积的DMEM/F12完全培养基终止消化，得到细胞悬液；
(c2)、将步骤(c1)得到的细胞悬液转移到离心管中，以1000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀；
(c3)、将步骤(c2)得到的细胞沉淀用PBS缓冲液清洗2遍，以1000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀；
(c4)、用PBS缓冲液重悬步骤(c3)得到的细胞沉淀，得到细胞悬液并进行计数；
(c5)、调节步骤(c4)得到的细胞悬液的细胞浓度为2×106个/ml，在铺有明胶的6孔板中各加入100ul细胞悬液，再补充2mlDMEM/F12完全培养基进行细胞培养；
(c6)、待细胞长至完全融合或过饱和时，更换培养基为含10％FBS的成人成脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基A，三天后换液为成脂诱导分化培养基B，24h后吸去成脂诱导分化培养基B换回含10％FBS的成人成脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基A进行诱导；
(c7)、含10％FBS的成人成脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基A与成脂诱导分化培养基B交替使用5次后，单纯B液培养7天，每2-3天半量换液；
(c8)、诱导结束后弃培养基，用PBS缓冲液洗涤，清洗2遍，4％多聚甲醛固定30min，吸去多聚甲醛溶液，用PBS缓冲液洗脱固定液2次，每次5min；
(c9)、油红O溶液：蒸馏水＝3：2稀释为工作液，每孔加入1ml油红O工作液，室温染色30min后，用PBS缓冲液洗脱染色液，显微镜下观察成脂染色情况，成脂分化的子宫内膜干细胞内出现多数橙子红色脂肪滴；其中：
含10％FBS的成人脂肪间质干细胞成脂诱导分化培养基A：成人脂肪间质干细胞成脂诱导分化培养基A液基础培养基175ml、成人脂肪间质干细胞成脂诱导分化用胎牛血清20ml、双抗2ml、谷氨酰胺2ml、胰岛素400ul、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤200ul、罗格列酮200ul、地塞米松200ul；成脂诱导分化培养基B：成人脂肪间质干细胞成脂诱导分化培养基B液基础培养基175ml、成人脂肪间质干细胞成脂诱导分化专用胎牛血清20ml、双抗2ml、谷氨酰胺2ml、胰岛素400ul。


4.如权利要求1所述的一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤二中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞，步骤二包括以下步骤：
(1)、在无菌条件下，取健康的脐带标本10-20cm，置于含1v/v％双抗的PBS缓冲液中；
(2)、将步骤(1)得到的脐带标本移至超净工作台中，反复用PBS缓冲液冲洗脐带标本，以去除残留血液；
(3)、在培养皿中剥离脐带标本的外膜、脐带动静脉后，将剩余组织块剪碎至体积小于1mm3；
(4)、向培养皿中加入DMEM/F12完全培养基，置于37℃、5v/v％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，4d后进行半量换液，待发现有细胞爬出后，每3d进行换液一次，传至第3代，待第3代脐带间充质干细胞达80-90％融合时，用0.25wt％胰酶水溶液消化细胞，EMEM/...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅松涛，
申请(专利权)人：山西宾大干细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山西;14