一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法。利用蛋白核小球藻（

【技术实现步骤摘要】
一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法
本专利技术属于环境毒理学领域，特别涉及一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法。该方法利用流式细胞仪检测农药污染物唑类杀菌剂（克霉唑）对蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa）细胞内活性氧含量的影响。
技术介绍
绿藻是水生生态系统的初级生产者，对水体的平衡和稳定起着极其重要的作用，是反映水体环境质量的重要指标。活性氧（ROS）对生物体十分重要，但过量会对生物体产生氧化损伤导致细胞死亡。由于ROS寿命短、反应活性高，且大部分都存在于体内很难被捕获，因此活体中ROS的直接检测对于解释生命机体的各种生理反应有着重要的意义。DCFH-DA是迄今最常用、最灵敏的细胞内ROS检测探针，进入细胞后被酯酶水解为DCFH，在ROS存在时DCFH被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质DCF。流式细胞术采用细胞作为实验对象，悬液中的单细胞或其他生物粒子通过检测标记的DCF荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选。传统的方法是将细胞进行孵育后，使用酶标仪、色谱分析等技术记录细胞所发射的荧光强弱确定细胞内ROS的含量，常常会忽略细胞数量变化所导致的荧光强度的改变。由于污染物的影响可能会导致处理组和对照组之间活细胞数目的差异，因此有必要对活细胞数量进行定量以补偿细胞数量不同所造成的荧光强度的差异。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法。使之可以更直观、全面地评价污染物对绿藻细胞内活性氧含量的的影响。具体步骤为：（1）试验液配置：称取目标污染物原药，溶于BG-II培养液中配置母液，并将母液稀释至所需浓度，配制成梯度浓度的试验液。（2）绿藻培养：选择纯培养条件下处于对数生长期的蛋白核小球藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用BG-II培养液稀释至所需的初始藻细胞浓度，获得处于对数生长期的蛋白核小球藻均匀藻液。（3）毒性暴露及藻细胞收集：采用摇瓶法，在无菌条件下，将步骤（2）获得的处于对数生长期的蛋白核小球藻均匀藻液，分装于250mL的锥形瓶中，每个锥形瓶20mL藻液；再次向各锥形瓶中依次添加步骤（1）配制的梯度浓度的试验液至总体积为100mL，并将BG-II培养液作为空白对照，使各个浓度组的每个目标污染物的浓度分别为0、0.008、0.08、0.8和8mg/L；加入目标污染物后，将蛋白核小球藻置于原培养条件下暴露处理，每天定时摇动3~4次，连续培养至96h后，取5mL均匀藻液，冷冻离心后收集藻细胞，用PBS洗涤1~2次离心收集细胞沉淀物。（4）装载荧光探针DCFH-DA及荧光检测：将DCFH-DA溶于培养基中混合均匀制得浓度为10μM的混合液，然后取1mL混合液加入到步骤（3）收集的细胞沉淀物中，37℃避光孵育细胞45min，将孵育后的藻细胞用培养基清洗2~3次，用PBS重悬，过滤后，采用流式细胞仪检测，通过DCF的荧光强度，反映不同浓度污染物暴露下对绿藻细胞内活性氧含量的影响，从而实现污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定。所述步骤（1）中的目标污染物是克霉唑。所述步骤（2）中的初始藻细胞浓度为4×105个cell/mL。所述步骤（3）中的原培养条件为：温度22℃，光照度2500~3000lux，光暗周期12h:12h。所述步骤（3）中冷冻离心的条件为：温度4℃，转速1500g，时间5min。所述步骤（4）中过滤采用的是70μmd的细胞滤网。所属步骤（4）中流式细胞仪的型号为CytoFLEX流式细胞分析仪。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：（1）本专利技术提供了一种操作简单、测试简便快速、实用性强的污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法；该方法定量的分析细胞发射的荧光强度，从而准确的判断细胞内活性氧的含量。（2）本专利技术提供了一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法，评价终点更加直观易判断，具有简单、易操作的优势。附图说明图1为本专利技术实施例中绿藻在不同浓度污染物暴露96h后的生长抑制率曲线图。图2为本专利技术实施例中空白对照（零污染物）暴露下绿藻细胞内DCF荧光信号值变化直方图。图3为本专利技术实施例中污染物暴露下绿藻细胞内DCF荧光信号值变化直方图，污染物的浓度为0.008mg/L。图4为本专利技术实施例中污染物暴露下绿藻细胞内DCF荧光信号值变化直方图，污染物的浓度为0.08mg/L。图5为本专利技术实施例中污染物暴露下绿藻细胞内DCF荧光信号值变化直方图，污染物的浓度为0.8mg/L。图6为本专利技术实施例中污染物暴露下绿藻细胞内DCF荧光信号值变化直方图，污染物的浓度为8mg/L。具体实施方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本专利技术而不限于限制本专利技术的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级，实验用水为超纯水，各试剂均和材料可以商用渠道获得，具体而言：实验中所用到的农药唑类杀菌剂克霉唑，购自CATOResearchChemicalsInc.。实施例：1.1相关药品的配制1.1.1配制BG-II培养基：绿藻的培养基采用BG-II培养基，其配方见表1。按照表1的配方配制BG-II培养基配方，其制备方法为：将表1中的成分配制成相应母液浓度，并按照标明顺序依次将相应母液用量转移至1000mL容量瓶中，密封并贴好标签，并用蒸馏水定容至1000mL，在121℃、101KPa下灭菌20min，灭完菌冷却后，置于4℃冰箱保存，有效期2个月。表1BG-II培养基配方注：使用1MNaOH或HCl将pH调至7.1。1.1.2检测物质农药唑类杀菌剂母液的配置：称取一定量的污染物原药，放入小烧杯中加BG-II培养基溶解定容。1.1.3毒性实验相关浓度的配制：用BG-II培养基将母液稀释并配制成梯度浓度的试验液。1.2确定初始接种藻细胞浓度：用血球计数法，将处于对数生长期的蛋白核小球藻在显微镜下进行藻细胞计数，计数三次，取平均值，并用BG-II培养基将藻液稀释到藻细胞浓度为4×105个cell/mL。1.3毒性暴露实验步骤1）开机预热紫外分光光度计15min，备用。2）摇瓶法具体步骤：在无菌条件下，将处于对数生长期、初始密度约为4×105cell/mL的蛋白核小球藻均匀藻液，分装于250mL的锥形瓶中，每瓶20mL藻液。在预实验的基础上将目标污染物设置4个实验组和1个对照组，每组设置3个平行。再次向各锥形瓶中依次添加对应剂量的唑类杀菌剂至总体积为100mL，使各个浓度组的目标污染物的浓度分别为0、0.008、0.08、0.8和8mg/L。加入目标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法，其特征在于具体步骤为：/n（1）试验液配置：称取目标污染物原药，溶于BG-II培养液中配置母液，并将母液稀释至所需浓度，配制成梯度浓度的试验液；/n（2）绿藻培养：选择纯培养条件下处于对数生长期的蛋白核小球藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用BG-II培养液稀释至所需的初始藻细胞浓度，获得处于对数生长期的蛋白核小球藻均匀藻液；/n（3）毒性暴露及藻细胞收集：采用摇瓶法，在无菌条件下，将步骤（2）获得的处于对数生长期的蛋白核小球藻均匀藻液，分装于250 mL的锥形瓶中，每个锥形瓶20 mL藻液；再次向各锥形瓶中依次添加步骤（1）配制的梯度浓度的试验液至总体积为100 mL，并将BG-II培养液作为空白对照，使各个浓度组的每个目标污染物的浓度分别为0、0.008、0.08、0.8和8mg/L；加入目标污染物后，将蛋白核小球藻置于原培养条件下暴露处理，每天定时摇动3~4次，连续培养至96 h后，取5mL均匀藻液，冷冻离心后收集藻细胞，用PBS洗涤1~2次离心收集细胞沉淀物；/n（4）装载荧光探针DCFH-DA及荧光检测：将DCFH-DA溶于培养基中混合均匀制得浓度为10μM的混合液，然后取1mL混合液加入到步骤（3）收集的细胞沉淀物中，37℃避光孵育细胞45min，将孵育后的藻细胞用培养基清洗2~3次，用PBS重悬，过滤后，采用流式细胞仪检测，通过DCF的荧光强度，反映不同浓度污染物暴露下对绿藻细胞内活性氧含量的影响，从而实现污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定；/n所述步骤（1）中的目标污染物是克霉唑；/n所述步骤（2）中的初始藻细胞浓度为4×10...

【技术特征摘要】
1.一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法，其特征在于具体步骤为：
（1）试验液配置：称取目标污染物原药，溶于BG-II培养液中配置母液，并将母液稀释至所需浓度，配制成梯度浓度的试验液；
（2）绿藻培养：选择纯培养条件下处于对数生长期的蛋白核小球藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用BG-II培养液稀释至所需的初始藻细胞浓度，获得处于对数生长期的蛋白核小球藻均匀藻液；
（3）毒性暴露及藻细胞收集：采用摇瓶法，在无菌条件下，将步骤（2）获得的处于对数生长期的蛋白核小球藻均匀藻液，分装于250mL的锥形瓶中，每个锥形瓶20mL藻液；再次向各锥形瓶中依次添加步骤（1）配制的梯度浓度的试验液至总体积为100mL，并将BG-II培养液作为空白对照，使各个浓度组的每个目标污染物的浓度分别为0、0.008、0.08、0.8和8mg/L；加入目标污染物后，将蛋白核小球藻置于原培养条件下暴露处理，每天定时摇动3~4次，连续培养至96h后，取5mL均匀藻液，冷冻离心后收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘敏，覃礼堂，莫凌云，梁延鹏，曾鸿鹄，宋晓红，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：广西;45