一种乳腺癌miRNA检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了联合检测miR‑1246、miR‑141和miR‑520a‑3p的表达水平在制备诊断乳腺癌的产品中的应用以及相关的检测试剂盒。另外，本发明专利技术还提供了miR‑1246、miR‑141和miR‑520a‑3p在制备治疗乳腺癌的药物组合物的应用以及相关的药物组合物。本发明专利技术的试剂盒能够作为乳腺癌诊断的手段之一，具有检测快速方便、检测灵敏度高、特异度好、成本低，可以满足绝大多数肿瘤病人的检测需求，应用范围广。本发明专利技术的药物组合物对乳腺癌有较好的抑制作用，在乳腺癌治疗中具有重要的参考意义和现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种乳腺癌miRNA检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及乳腺癌相关的miRNA检测试剂盒及其应用，属于生物医药领域，具体属于分子生物学

技术介绍
乳腺癌(breastcancer)是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中99％发生在女性，男性仅占1％。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。近年，我国乳腺癌发病率的增长速度高出高发国家1～2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率全国合计约为42.55/10万，城市约为51.91/10万，农村约为23.12/10万。乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。乳腺癌早早期时临床无症状，隐匿阶段平均为12年，等到有明显症状时多已是中晚期。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。最近的研究表明大约70％的哺乳动物miRNA是位于TUs区(transcriptionunits,TUs),且其中大部分是位于内含子区。一些内含子miRNA的位置在不同的物种中是高度保守的。miRNA不仅在基因位置上保守,序列上也呈现出高度的同源性。miRNA高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。miRNA与其靶基因的进化有着密切的联系,研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。越来越多的文献报道MicroRNA在癌症的发生、发展、转移中起重要的功能，而且抑制或者过表达一些MicroRNA能够抗癌。因此，针对乳腺癌，有必要去研究是否有MicroRNA也能起到抗癌或延缓癌症发生发展的作用。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种与乳腺癌发生发展相关的的miRNAs标志物，所述标志物可以作为乳腺癌的特异性诊断标志物；本专利技术的目的之二在于提供miRNAs标志物在筛选治疗乳腺癌的候选药物中的应用。因此，本专利技术一方面提供了一种miRNAs，和联合检测miRNAs表达水平的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用，所述的miRNAs为miR-1246、miR-141和miR-520a-3p。再一方面，本专利技术提供了一种乳腺癌miRNA检测试剂盒，所述试剂盒包括联合检测miR-1246、miR-141和miR-520a-3p表达水平的试剂，所述的检测miR-1246、miR-141和miR-520a-3p表达水平的试剂包括PCR反应液，所述PCR反应液包括引物对和Taqman探针，所述引物对和Taqman探针的序列如下：miR-1246-F：5’-TGTATCCTTGAATGGATTTT-3’；miR-1246-R：5’-TCAATCCATAGGCTAGCAAT-3’；miR-1246-Taqman-MGB：5’-FAM-AGTGGACACCTGACCCAAAG-MGB-3’；miR-141-F：5’-CGGCCGGCCCTGGGTCCATC-3’；miR-141-R：5’-GATGGCTCCCGGGTGGGTTC-3’；miR-141-Taqman-MGB：5’-HEX-TTGTGAAGCTCCTAACACTG-MGB-3’；miR-520a-3p-F：5’-CTCAGGCTGTGACCCTCCAG-3’；miR-520a-3p-R：5’-TTGGACTGTTTCGGTTTGAG-3’；miR-520a-3p-Taqman-MGB：5’-ROX-CTGTTGTCTGAGAGAA-MGB-3’。优先地，本专利技术所述miR-1246Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，miR-141Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；miR-520a-3pTaqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。优先地，本专利技术所述的PCR反应液还包括内参基因U6的引物对和Taqman探针，所述引物对和Taqman探针的序列如下：U6-F：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’；U6-R：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6-Taqman-MGB：5’-CY5-CCTGCGCAAGGATGACACG-MGB-3’。优先地，本专利技术所述的U6Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。优先地，本专利技术所述的PCR反应液还包括2×OneStepRT-PCRBuffer。优先地，本专利技术所述的试剂盒还包括酶混合物：PrimeScriptRTEnzymeMix。优先地，本专利技术所述的试剂盒的反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；95℃5s，58℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。优先地，本专利技术所述的试剂盒的判定公式为：Y＝0.0261*AmiR-1246+0.0941*BmiR-141-0.0352*CmiR-520a-3p；其中，AmiR-1246是miR-1246的表达量，BmiR-141是miR-141的表达量，CmiR-520a-3p是miR-520a-3p的表达量；当Y≥0.05时判断为阳性；当Y＜0.0499时判为阴性。再一方面，本专利技术还提供了一种miR-1246、miR-141和miR-520a-3p基因的用途，其特征在于，用于制备治疗乳腺癌的药物组合物。优先地，本专利技术所述药物组合物包括miR-1246、miR-141基因的抑制剂和miR-520a-3p。优先地，本专利技术所述miR-1246基因的抑制剂为si-miR-1246，si-miR-1246的序列如SEQIDNO.1所示。优先地，本专利技术所述的miR-141基因的抑制剂为si-miR-141，si-miR-1246的序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，筛选用于乳腺癌诊断和治疗的miRNAs标志物，从中选择miR-1246、miR-141和miR-520a-3p作为组合分子标记物(在乳腺癌中，miR-1246、miR-141上调，但miR-520a-3p下调)。在此基础上，本专利技术提供了联合检测miR-1246、miR-141和miR-520a-3p的表达水平在制备诊断乳腺癌的产品中的应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乳腺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括联合检测miR-1246、miR-141和miR-520a-3p表达水平的试剂，所述的检测miR-1246、miR-141和miR-520a-3p表达水平的试剂包括PCR反应液，所述PCR反应液包括引物对和Taqman探针，所述引物对和Taqman探针的序列如下：/nmiR-1246-F：5’-TGTATCCTTGAATGGATTTT-3’；/nmiR-1246-R：5’-TCAATCCATAGGCTAGCAAT-3’；/nmiR-1246-Taqman-MGB：5’-FAM-AGTGGACACCTGACCCAAAG-MGB-3’；/nmiR-141-F：5’-CGGCCGGCCCTGGGTCCATC-3’；/nmiR-141-R：5’-GATGGCTCCCGGGTGGGTTC-3’；/nmiR-141-Taqman-MGB：5’-HEX-TTGTGAAGCTCCTAACACTG-MGB-3’；/nmiR-520a-3p-F：5’-CTCAGGCTGTGACCCTCCAG-3’；/nmiR-520a-3p-R：5’-TTGGACTGTTTCGGTTTGAG-3’；/nmiR-520a-3p-Taqman-MGB：5’-ROX-CTGTTGTCTGAGAGAA-MGB-3’。/n...

【技术特征摘要】
1.一种乳腺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括联合检测miR-1246、miR-141和miR-520a-3p表达水平的试剂，所述的检测miR-1246、miR-141和miR-520a-3p表达水平的试剂包括PCR反应液，所述PCR反应液包括引物对和Taqman探针，所述引物对和Taqman探针的序列如下：
miR-1246-F：5’-TGTATCCTTGAATGGATTTT-3’；
miR-1246-R：5’-TCAATCCATAGGCTAGCAAT-3’；
miR-1246-Taqman-MGB：5’-FAM-AGTGGACACCTGACCCAAAG-MGB-3’；
miR-141-F：5’-CGGCCGGCCCTGGGTCCATC-3’；
miR-141-R：5’-GATGGCTCCCGGGTGGGTTC-3’；
miR-141-Taqman-MGB：5’-HEX-TTGTGAAGCTCCTAACACTG-MGB-3’；
miR-520a-3p-F：5’-CTCAGGCTGTGACCCTCCAG-3’；
miR-520a-3p-R：5’-TTGGACTGTTTCGGTTTGAG-3’；
miR-520a-3p-Taqman-MGB：5’-ROX-CTGTTGTCTGAGAGAA-MGB-3’。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的miR-1246Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，miR-141Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；miR-520a-3pTaqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液还包括内参基因U6的引物对和Taqman探针，所述引物对和Taqman探针的序列如下：
U6-F：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’；

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫国，
申请(专利权)人：陈卫国，
类型：发明
国别省市：广东;44