一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法，该方法为：将天然HNTs纯化后重悬、超声干燥、研磨后，得到HNTs粉末，将短肽RG5溶解于PBS缓冲液中，加入HNTs粉末，震荡混匀、抽真空后离心，将沉淀物洗涤后，低温冷冻真空干燥、研磨得到HNTs/RG5纳米复合止血粉；还提供了应用，用于体外凝血。本发明专利技术真空负压循环操作的情况下，克服HNTs纳米管的毛细阻力，吸附短肽RG5进入HNTs管腔，而后进行低温冷冻干燥制备快速止血粉，保证了短肽RG5的活性，HNTs/RG5纳米复合止血粉可在较低浓度时激活血小板从而发挥体外凝血作用。

【技术实现步骤摘要】
一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法及其应用
本专利技术属于纳米止血粉
，具体涉及一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法及其应用。
技术介绍
出血是创伤发生后最常见的临床表现之一，无法控制的大出血仍然是和平时代和战时造成死亡率居高不下的主要原因。肽是氨基酸分子按一定的次序经肽键连接而成，广泛存在于生物体内，并具有重要的生理作用。研究发现许多肽类化合物具有良好的止血效果，它们通过影响凝血过程中的不同环节而发挥作用。肽类止血材料在体内可自然降解，无毒，生物相容性高，作用靶点明确，产业化生产相对容易且止血性能优良，在生物医学领域有很好的发展前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法及其应用，该方法在真空负压循环操作的情况下，克服HNTs纳米管的毛细阻力，吸附短肽RG5进入HNTs管腔，而后进行低温冷冻干燥制备快速止血粉，保证了短肽RG5的活性，HNTs/RG5纳米复合止血粉可在较低浓度时激活血小板从而发挥体外凝血作用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法，该方法为：S1、将未经纯化的天然HNTs加入至超纯水a中搅拌后，加入六偏磷酸钠，磁力揽拌30min～40min，得到混合体系，静置分层后，收集上层悬浮液，在转速为9000rpm～10000rpm的条件下离心10min～20min，收集沉淀物，并用超纯水b洗涤3～4次，得到纯化HNTs，加入超纯水c重悬，并在功率为300W～400W的条件下超声处理20min～30min后，在温度为45℃～60℃的条件下干燥10h～12h，然后研磨，得到HNTs粉末；S2、将短肽RG5溶解于PBS缓冲液中，然后加入S1中得到的HNTs粉末，在转速为150r/min的条件下上震荡混匀20min～30min后，在真空干燥机中反复抽真空两次，每次抽真空的时间为30min～40min，然后在转速为在9000rpm～10000rpm的条件下离心10min～20min后，弃去上清液，将沉淀物用超纯水d洗涤2～3次后，在低温冷冻真空干燥后，研磨得到HNTs/RG5纳米复合止血粉；所述短肽RG5具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；所述低温冷冻真空干燥的条件为：温度为-50℃～-60℃，真空度为1.3Pa～13Pa，干燥的时间为36h～48h。本专利技术中埃洛石纳米管(Halloysitenanotubes，HNTs)为硅酸盐类矿物，化学式为Al2Si2O5(OH)4·nH2O，HNTs结构由外层的硅氧四面体和内层的铝氧八面体组合而成，自然条件下弯曲，具有中空管状结构。HNTs的管内径大约10-20nm，外径大约40-70nm，内腔负载的容积大约为4％-18％，同时管两端开口、无卷曲破裂或套管现象。HNTs的内外表面分别含有Al-OH和O-Si-O基团而导致内外表面带不同电荷，有利于其与不同带电粒子结合；同时，HNTs的中空管状结构及其较大的比表面积利于负载多种物质，如肽、小分子药物等，以减少外界环境的破坏；HNTs还具有天然形成、储量丰富、性价比高、生物相容性好等多种优点，在载药性方面具有很好的应用潜力，可以利用其中空的结构来负载某些小分子物质或者化学单体；同时，埃洛石纳米管具有良好的促凝血作用，并低浓度下(50μg/mL)就可激活血小板。本专利技术的短肽RG5是一个具有五个氨基酸的短肽，其中三个氨基酸(Arg、Gly和Asp)均为亲水的氨基酸，亲水残基比例60％～80％，亲水性极强，极易在空气中潮解，且粘性较大，在真空负压循环操作的情况下，可成功克服纳米管的毛细阻力，吸附短肽RG5进入HNTs管腔，而后进行低温冷冻干燥制备快速止血粉，整个过程为物理操作，无化学添加，全程保证了短肽RG5的活性。优选地，S1中所述混合体系中天然HNTs、超纯水a和六偏磷酸钠的用量比为10g：500mL：0.05g。优选地，S1中静置的时间为20min～30min。优选地，S1中纯化HNTs和超纯水c的用量比为1g：10mL。优选地，S1中所述HNTs粉末的微粒长度为200nm～1000nm；所述HNTs粉末的含水量≤1％。优选地，S2中所述短肽RG5的制备方法为：S201、将5g的Fmoc-Gly-WangResin王树脂放到反应柱中，用50mL的二氯甲烷浸泡1min后抽干，加入50mL的质量分数为20％的六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在室温的条件下用氮气鼓动15min，脱去Fmoc，抽干后用N,N-二甲基甲酰胺冲洗9次，再抽干，得到Gly-树脂柱；S202、向S201中得到的Gly-树脂柱中加入1.86g的Fmoc-Ala-oH、1.92g的缩合剂TBTU、50mL的N,N-二甲基甲酰胺和0.5mL的N-甲基吗啡，在室温的条件下用氮气鼓动25min后抽干，用N,N-二甲基甲酰胺冲洗6次后抽干，得到Fmoc-Ala-Gly-树脂柱；S203、向S202中得到的Fmoc-Ala-Gly-的树脂柱中加入50mL的质量分数为20％的六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在室温的条件下用氮气鼓动15min,脱去Fmoc，抽干后用N,N-二甲基甲酰胺冲洗6次，得到Ala-Gly-的树脂柱；S204、向S203中得到的Ala-Gly-的树脂柱中加入1.86g的Fmoc-Arg-oH、1.92g的缩合剂TBTU、50mL的N,N-二甲基甲酰胺和0.5mL的N-甲基吗啡，在室温的条件下用氮气鼓动25min后抽干，用N,N-二甲基甲酰胺冲洗6次后抽干，得到Fmoc-Arg-Ala-Gly-树脂柱；S205、向S204中得到的Fmoc-Arg-Ala-Gly-树脂柱中加入50mL的质量分数为20％的六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在室温的条件下用氮气鼓动15min,脱去Fmoc，抽干后用N,N-二甲基甲酰胺冲洗6次，得到Arg-Ala-aly-树脂柱；S206、向S205中得到的Arg-Ala-Gly-树脂柱中加入1.86g的Fmoc-Gly-oH、1.92g的缩合剂TBTU、50mL的N,N-二甲基甲酰胺和0.5mL的N-甲基吗啡，在室温的条件下用氮气鼓动25min后抽干，用N,N-二甲基甲酰胺冲洗6次后抽干，得到Fmoc-Gly-Arg-Ala-Gly-树脂柱；S207、向S206中得到的Fmoc-Gly-Arg-Ala-Gly-树脂柱中加入50mL的质量分数为20％的六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在室温的条件下用氮气鼓动15min,脱去Fmoc，抽干后用N,N-二甲基甲酰胺冲洗6次，得到Gly-Arg-Ala-Gly-树脂柱；S208、向S207中得到的Gly-Arg-Ala-Gly-树脂柱中加入1.86g的Fmoc-Asp-oH、1.92g的缩合剂TBTU、50mL的N,N-二甲基甲酰胺和0.5mL的N-甲基吗啡，在室温的条件下用氮气鼓动25mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法，其特征在于，该方法为：/nS1、将未经纯化的天然HNTs加入至超纯水a中搅拌后，加入六偏磷酸钠，磁力揽拌30min～40min，得到混合体系，静置分层后，收集上层悬浮液，在转速为9000rpm～10000rpm的条件下离心10min～20min，收集沉淀物，并用超纯水b洗涤3～4次，得到纯化HNTs，加入超纯水c重悬，并在功率为300W～400W的条件下超声处理20min～30min后，在温度为45℃～60℃的条件下干燥10h～12h，然后研磨，得到HNTs粉末；/nS2、将短肽RG5溶解于PBS缓冲液中，然后加入S1中得到的HNTs粉末，在转速为150r/min的条件下上震荡混匀20min～30min后，在真空干燥机中反复抽真空两次，每次抽真空的时间为30min～40min，然后在转速为在9000rpm～10000rpm的条件下离心10min～20min后，弃去上清液，将沉淀物用超纯水d洗涤2～3次后，在低温冷冻真空干燥后，研磨得到HNTs/RG5纳米复合止血粉；所述短肽RG5具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；所述低温冷冻真空干燥的条件为：温度为-50℃～-60℃，真空度为1.3Pa～13Pa，干燥的时间为36h～48h。/n...

【技术特征摘要】
1.一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法，其特征在于，该方法为：
S1、将未经纯化的天然HNTs加入至超纯水a中搅拌后，加入六偏磷酸钠，磁力揽拌30min～40min，得到混合体系，静置分层后，收集上层悬浮液，在转速为9000rpm～10000rpm的条件下离心10min～20min，收集沉淀物，并用超纯水b洗涤3～4次，得到纯化HNTs，加入超纯水c重悬，并在功率为300W～400W的条件下超声处理20min～30min后，在温度为45℃～60℃的条件下干燥10h～12h，然后研磨，得到HNTs粉末；
S2、将短肽RG5溶解于PBS缓冲液中，然后加入S1中得到的HNTs粉末，在转速为150r/min的条件下上震荡混匀20min～30min后，在真空干燥机中反复抽真空两次，每次抽真空的时间为30min～40min，然后在转速为在9000rpm～10000rpm的条件下离心10min～20min后，弃去上清液，将沉淀物用超纯水d洗涤2～3次后，在低温冷冻真空干燥后，研磨得到HNTs/RG5纳米复合止血粉；所述短肽RG5具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；所述低温冷冻真空干燥的条件为：温度为-50℃～-60℃，真空度为1.3Pa～13Pa，干燥的时间为36h～48h。


2.根据权利要求1所述的一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法，其特征在于，S1中所述混合体系中天然HNTs、超纯水a和六偏磷酸钠的用量比为10g：500mL：0.05g。


3.根据权利要求1所述的一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法，其特征在于，S1中静置的时间为20min～30min。


4.根据权利要求1所述的一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法，其特征在于，S1中纯化HNTs和超纯水c的用量比为1g：10mL。


5.根据权利要求1所述的一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法，其特征在于，S1中所述HNTs微粒的长度为200nm～1000nm，内径10nm～20nm，外径40nm～70nm；所述HNTs粉末的含水量≤1％。


6.根据权利要求1所述的一种HNTs/RG5纳米复合止血粉的制备方法，其特征在于，S2中所述短肽RG5的制备方法为：
S201、将5g的Fmoc-Gly-WangResin王树脂放到反应柱中，用50mL的二氯甲烷浸泡1min后抽干，加入50mL的质量分数为20％的六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在室温的条件下用氮气鼓动15min，脱去Fmoc，抽干后用N,N-二甲基甲酰胺冲洗9次，再抽干，得到Gly-树脂柱；
S202、向S201中得到的Gly-树脂柱中加入1.86g的Fmoc-Ala-oH、1.92g的缩合剂TBTU、50mL的N,N-二甲基甲酰胺和0.5mL的N-甲基吗啡，在室温的条件下用氮气鼓动25min后抽干，用N,N-二甲基甲酰胺冲洗6次后抽干，得到Fmoc-Ala-Gly-树脂柱；
S203、向S202中得到的Fmoc-Ala-Gly-的树脂柱中加入50mL的质量分数为20％的六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在室温的条件下用氮气鼓动15min,脱去Fmoc，抽干后用N,N-二甲基甲酰胺冲洗6次，得到Ala-Gly-的树脂柱；
S204、向S203中得到的Ala-Gly-的树脂柱中加入1.86g的Fmoc-Arg-oH、1.92g的缩合剂TBTU、50mL的N,N-二甲基甲酰胺和0.5mL的N-甲基吗啡，在室温的条件下用氮气鼓动25min后抽干，用N,N-二甲基甲酰胺冲洗6次后抽干，得到Fmoc-Arg-Ala-Gly-树脂柱；
S205、向S204中得到的Fmoc-Arg-Ala-Gly-树脂柱中加入50mL的质量分数为20％的六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在室温的条件下用氮气鼓动15min,脱去Fmoc，抽干后用N,N-二甲基甲酰胺冲洗6次，得到Arg-Ala-aly-树脂柱；
S206、向S205中得到的Arg...

【专利技术属性】
技术研发人员：张天蔚，田卫群，赵健，吕芯怡，董齐，陈挥颖，
申请(专利权)人：田卫群，
类型：发明
国别省市：湖北;42