一种基于萘酰亚胺-吲哚衍生物的细胞内质网荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于萘酰亚胺‑吲哚衍生物类的细胞内质网荧光探针及其应用。本发明专利技术所述荧光探针是一种萘酰亚胺‑吲哚衍生物类染料，荧光量子产率高、双光子吸收截面积大，其结构通式如式Ⅰ所示。本发明专利技术合成工艺简便，反应条件温和，产率较高；原料易得，制备成本低廉；所述内质网荧光探针定位特异性高，可用于活细胞或活体的时间分辨荧光成像和双光子荧光成像。

【技术实现步骤摘要】
一种基于萘酰亚胺-吲哚衍生物的细胞内质网荧光探针及其应用
本专利技术属于小分子荧光材料领域，涉及一种基于萘酰亚胺-吲哚衍生物类的细胞内质网荧光探针及其应用。
技术介绍
内质网(endoplasmicreticulum,ER)是由细胞质中单位膜围成的小管(tubule)，小泡(vesicle)或扁囊(cisternae)连接成的三维网状膜系统，约占细胞内膜面积的二分之一，内质网形态和组成具有高度多样性和动态性，与细胞的类型和状态密切相关。内质网是真核细胞中重要细胞器，参与细胞的多个生理过程，细胞内蛋白质后修饰与加工(如糖基化、羟基化等)、新生肽链的折叠、组装和运输，细胞内的磷脂、胆固醇等脂类的合成代谢、糖原的合成、以及钙离子的储存等均与内质网的功能有关，因此，内质网对维持细胞生理活动和功能具有重要意义。蛋白异常表达、病毒感染、抑制剂以及钙调节异常等内外诱导因子都可导致内质网应激，从而诱发神经退行性疾病、糖尿病和癌症等多种疾病。因此，对内质网形态、分布的实时动态成像和示踪，可帮助深入理解内质网在细胞生理过程中的作用以及相关疾病发生、发展机制。有机小分子荧光探针因其高灵敏度，特异性，快速响应和简单易得而成为生物传感和生物成像的强大工具。目前使用较多的商用内质网荧光探针为DiOC6(3,3’-dihexyloxacarbocyanineiodide)和ER-Tracker系列，但DiOC6内质网定位选择性不高，低浓度时主要定位线粒体；而ER-Tracker探针靶向内质网上的钾离子通道蛋白的磺脲类(sulphonylurea)受体，影响细胞内正常生理活动，且价格昂贵。近年来，活细胞中靶向内质网结构的新型有机荧光探针已有报道，但探针数量远远不够，无法满足对内质网研究的需要，且这些探针普遍存在合成步骤繁琐、分子量大、结构复杂、定位特异性不高、干扰内质网正常生理功能、以及荧光背景干扰大、无法用于活细胞长时间成像等问题。双光子染料利用长波长的近红外光作为激发光，光漂白和光毒性小，适用于活细胞成像。萘酰亚胺是优秀的双光子染料，其荧光量子产率高、双光子吸收截面积大。吲哚是重要的杂环化合物，吲哚衍生物在自然界分布广泛，吲哚衍生物常与生命活动密切相关，如N-乙酰基-5-甲氧基色胺(CAS号：73-31-4)，即褪黑素(又称为褪黑激素、美拉酮宁、抑黑素、松果腺素)，是一种胺类激素，具有抗衰老、调节免疫、抗肿瘤等多种生理功能。目前以1,8-萘二甲酰亚胺为荧光母体的吲哚衍生物作为高特异性内质网荧光探针还未见报道，因此，设计合成这类1,8-萘二甲酰亚胺-吲哚类衍生物，利用该类探针对内质网进行荧光成像或双光子荧光成像，对内质网形态和分布进行实时观察，对于研究内质网的生理过程及内质网相关疾病发生、发展机制，具有重要研究意义和价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于萘酰亚胺-吲哚衍生物类的细胞内质网荧光探针及其应用。本专利技术提供的1,8-萘二甲酰亚胺-吲哚衍生物荧光背景小、双光子吸收截面大、内质网定位特异性高。本专利技术提供的基于萘酰亚胺-吲哚衍生物类的细胞内质网荧光探针，也即式Ⅰ所示化合物，所述式Ⅰ中，R1和R2独立选自H、基团a至基团f中任意一种；R3和R4独立地选自H和基团a中任意一种；所述基团a为含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～9的直链、支链或成环的烷基；所述基团b为含有取代基的所述基团a；所述基团c为碳原子数为6～10的芳基；所述基团d为含有取代基的碳原子数为6～10的芳基；所述基团e为含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～9的直链、支链或成环的杂环基；所述基团f为含有取代基的所述基团e；所述取代基选自羟基、胺基、巯基、碳原子数1-6的烷氧基、羰基和卤素中的一种。上述式Ⅰ中，所述基团e为含有N、O或S的五元、六元或七元杂环或苯并杂环基；所述芳基为苯基或萘基；更具体的，所述碳原子数为1～9的直链、支链或成环的烷基中，碳原子数具体为1、2、3、4、5、6、7、8或9；所述碳原子数1-6的烷氧基中，碳原子数具体为1、2、3、45或6；再具体的，所述R1和R2选自H、碳原子数为1-6的烷氧基或-O-C6H5中任意一种；更具体为H或甲氧基或-O-C6H5；所述R3和R4选自-(CH2)2-、-(CH2)2-NHCO-(CH2)3-或-NH-(CH2)3-CONH-(CH2)2-；所述式Ⅰ所示化合物具体为式Ⅱ至式Ⅵ所示化合物中任意一种：本专利技术提供的制备所述式I所示化合物的方法，包括：将式Ⅶ所示化合物、亲核试剂和缚酸剂于溶剂中进行亲核取代反应，得到所述式Ⅰ所示化合物；所述式Ⅶ中，R1和R3的定义与式Ⅰ中的定义相同。上述方法中，所述亲核试剂为氨基-吲哚衍生物；具体选自5-甲氧基色胺、色胺、5-甲基色胺、5-氟色胺、5-氯色胺、2-甲基色胺、6-甲氧基色胺、5-羟色胺、7-甲基色胺和5-苄氧基色胺中任意一种；所述缚酸剂为碱盐；具体选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠和氢化钾中任意一种；所述亲核取代反应在溶剂中进行；所述溶剂具体选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺的至少一种；所述式Ⅶ所示化合物与氨基-吲哚衍生物的投料摩尔比为1:1.5-2.5；具体为1:2；所述式Ⅶ所示化合物与碱盐的投料摩尔比为1：1.5-4；具体为1:2.6；所述亲核取代反应步骤中，温度为20℃-120℃；具体为85℃；时间为4-24h；具体为12h。所述方法还包括：在所述亲核取代反应步骤之后，将反应体系干燥和纯化；所述纯化具体为用柱层析分离和高效液相色谱纯化；具体的，所述用柱层析分离步骤中，淋洗液为二氯甲烷：甲醇＝100:1(v/v)；所述高效液相色谱纯化步骤中，色谱柱为Promisil-C18柱(250mm×4.6mm,20μm)，流动相为甲醇-水，梯度洗脱，洗脱程序：0-25min,甲醇40％-95％，25-30min，甲醇95％；检测波长为450nm；柱温为25℃；体积流量为1.0mL·min-1；进样量为100μL。本专利技术还要求保护一种试剂盒，由式Ⅰ所示化合物和溶剂组成；所述式Ⅰ所示化合物在所述溶剂中的浓度为0.1～100μM；所述溶剂具体为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、细胞培养基或二甲基亚砜。上述试剂盒中，所述细胞培养基为RPMI-1640和DMEM。另外，上述本专利技术提供的式Ⅰ所示化合物或所述试剂盒在活细胞、固定细胞、组织或活体中内质网荧光成像或双光子荧光成像的应用，也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还要求保护上述式I所示化合物或试剂盒在制备活细胞、固定细胞、组织或活体中内质网荧光成像或双光子荧光成像的产品中的应用；具体的，所述活细胞为癌细胞；具体为HeLa细胞(人宫颈癌细胞)、A549细胞(人肺癌细胞)、DU145细胞(人前列腺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.式Ⅰ所示化合物，/n

【技术特征摘要】
1.式Ⅰ所示化合物，



所述式I中，R1和R2独立选自H、基团a至基团f中任意一种；
R3和R4独立地选自H和基团a中任意一种；
所述基团a为含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～9的直链、支链或成环的烷基；
所述基团b为含有取代基的所述基团a；
所述基团c为碳原子数为6～10的芳基；
所述基团d为含有取代基的碳原子数为6～10的芳基；
所述基团e为含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～9的直链、支链或成环的杂环基；
所述基团f为含有取代基的所述基团e；
所述取代基选自羟基、胺基、巯基、碳原子数1-6的烷氧基、羰基和卤素中的一种。


2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述基团e为含有N、O或S的五元、六元或七元杂环或苯并杂环基；
所述芳基为苯基或萘基；
所述式Ⅰ所示化合物具体为式Ⅱ至式Ⅵ所示化合物中任意一种：








3.一种制备权利要求1或2任一所述式Ⅰ所示化合物的方法，包括：
将式Ⅶ所示化合物、亲核试剂和缚酸剂于溶剂中进行亲核取代反应，得到所述式Ⅰ所示化合物；






所述式Ⅶ中，R1和R3的定义与权利要求1中式Ⅰ中的定义相同。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述亲核试剂为氨基-吲哚衍生物；具体选自5-甲氧基色胺，色胺、5-甲基色胺、5-氟色胺、5-氯色胺、2-甲基色胺、6-甲氧基色胺、5-羟色胺、7-甲基色胺和5-苄氧基色胺中任意一种；；
所述缚酸剂为碱盐；具体选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠和氢化钾中任意一种；
所述亲核取代反应在溶剂中进行；所述溶剂具体选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：上官棣华，张楠，王妍，刘祥军，邴涛，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11