一种用于检测水稻香味基因的KASP分子标记和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检测水稻香味基因的KASP分子标记，包括：正向引物1：5'‑TGGCCCGGACGGCGCC‑3'；正向引物2：5'‑GGCCCGGACGGCGCG‑3'，和通用反向引物：5'‑CGGGAGGCGCTGAAGAGGAA‑3'。本发明专利技术还公开一种用上述分子标记检测水稻香味基因的方法，相较于常规分子标记方法，该方法省去PCR后的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，可以快速、准确的检测出香味基因，具有简单、准确、高效和低成本的优点，极大地促进了水稻香味基因的分子标记辅助选择技术应用，对优质香稻新品种的选育具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测水稻香味基因的KASP分子标记和检测方法
本专利技术涉及一种快速检测大量群体水稻香味基因的KASP分子标记及其方法，属于农业分子生物

技术介绍
随着当前城乡居民稻米消费水平的提高，高端优质大米市场开发的经济价值和市场前景日益受到关注。而香味作为评价优质米的一项重要指标，由于其在大米储藏和米饭蒸煮过程中散发出怡人香气，一直受到消费者的青睐。市场上的高档大米也大多为香米，长期以来优质香味米品种的选育受到广泛重视。研究发现，香稻含有多种挥发性化合物，而直接与水稻香味相关的挥发性物质为2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2AP)。国内外学者对水稻香味性状的遗传学研究结果表明，由于甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2功能的缺失会导致2AP前体物质的增加，从而积累2AP使稻米产生香味。Bradbury等首先发现水稻第8染色体Badh2基因第7外显子8bp缺失及3bp突变产生无功能蛋白导致水稻香味，Chen等还发现了Badh2中的另外一个等位基因可以导致水稻香味的产生，即第2外显子7bp的缺失。到目前为止该基因序列已经有10多处位点的变异被相继报道。分子标记辅助选择(marker—assistedselection，MAS)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。利用MAS技术根据香味基因序列差异开发一系列的分子标记来鉴定香味基因的手段已经开始应用于香稻分子育种。针对Badh2基因第2外显子7bp的缺失位置，王军等设计了检测香味基因的InDel(insertion-deletion，InDel)标记InDel-E2，利用该标记引物对水稻基因组DNA模板进行PCR扩增，扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后根据片段差异可以区分水稻香味基因的基因型。但是该检测方法制胶过程繁琐，电泳时间较长，给香稻育种中大规模基因型检测带来很大困难。KASP是竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAlleleSpecificPCR)的缩写，可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs(单碱基变异)和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。本专利技术根据Badh2基因第2外显子7bp的缺失位置开发了一个KASP分子标记Badh2-E2-KASP，可以准确检测该突变类型的香稻材料。该标记具有高通量、低成本和高准确性的特点，在香稻分子育种中具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测水稻香味控制基因Badh2第2外显子7bp的缺失位置的KASP标记引物，检测水稻香味控制基因Badh2的基因型，具有高通量、低成本和高准确性的特点，结果准确可靠，方便快捷，成本低，将在香稻分子育种中发挥重要作用。所述的一种水稻香味基因，其特征在于与正常的Badh2基因相比，其第2外显子处发生了7bp的碱基缺失，该位置位于基因转录起始密码子下游304bp到310bp之间，缺失序列为GGCGCCG。本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测水稻香味基因的KASP分子标记Badh2-E2-KASP，其特征在于，所述分子标记包括：正向引物1：5'-TGGCCCGGACGGCGCC-3'；正向引物2：5'-GGCCCGGACGGCGCG-3'，和通用反向引物：5'-CGGGAGGCGCTGAAGAGGAA-3'。进一步地，正向引物1的5'端带有FAM荧光信号标签，序列为：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'。进一步地，正向引物2的5'端带有HEX荧光信号标签，序列为：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。本专利技术第二个目的在于提供上述分子标记在快速检测水稻香味基因Badh2-E2中的应用。本专利技术第三个目的是提供一种快速检测水稻香味基因Badh2-E2的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)提取水稻植株基因组DNA；(2)用PCR引物对水稻植株基因组DNA进行PCR扩增；所述PCR引物序列为：正向引物1：5'-TGGCCCGGACGGCGCC-3'；正向引物2：5'-GGCCCGGACGGCGCG-3'；通用反向引物：5'-CGGGAGGCGCTGAAGAGGAA-3'；所述正向引物1的5'端带有FAM荧光信号标签，序列为：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'；所述正向引物2的5'端带有HEX荧光信号标签，序列为：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'；(3)用酶标仪对反应产物进行检测，根据SNPviewer软件确定检测水稻样品的基因型。本专利技术提供的快速检测水稻香味基因Badh2-E2的方法具体包括以下步骤：(1)提取水稻样品基因组DNA，溶解后确保样品DNA终浓度约为10ng/μL。(2)利用上述引物进行PCR扩增，正向引物1的5'端需加上FAM荧光信号标签，正向引物2的5'端需加上HEX荧光信号标签。PCR反应体系为1μL，包括2×KASPMastermix0.5μL，72*Assaymix0.014μL，模板DNA0.1μL，ddH2O0.386μL。PCR反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。(3)反应完成，吹干降温后在酶标仪Pherastar上进行读板，然后将数据导入SNPviewer软件查看分型效果。根据颜色分类，聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型。左下角显示黑色的样本为空白对照。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：利用本专利技术的KASP标记引物，对水稻香味控制基因Badh2第2外显子7bp的缺失位置基因型进行检测，方法简单易行，结果准确可靠，减少时间和人工成本的同时又可以高通量检测多个样品，大大提高了检测效率，将在香稻新品种选育中发挥重要作用。附图说明图1为本专利技术的KASP标记的分型示意图。图2为本专利技术实施例中利用成熟的InDel分子标记对KASP标记分型样本部分结果验证图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1利用KASP分子标记Badh2-E2-KASP引物检测水稻香味控制基因。以香稻品种“南粳46”为供体亲本，与不同的非香常规粳稻品种杂交，在杂交后代中随机选择69个样品作为样本群体。1.利用CTAB法提取水稻样品全基因组DNA。1)分蘖盛期取水稻幼嫩片放入液氮预冷过的研钵中，加入液氮研本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测水稻香味基因的KASP分子标记Badh2-E2-KASP，其特征在于，所述分子标记包括：/n正向引物1：5'-TGGCCCGGACGGCGCC-3'；/n正向引物2：5'-GGCCCGGACGGCGCG-3'，和/n通用反向引物：5'-CGGGAGGCGCTGAAGAGGAA-3'。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测水稻香味基因的KASP分子标记Badh2-E2-KASP，其特征在于，所述分子标记包括：
正向引物1：5'-TGGCCCGGACGGCGCC-3'；
正向引物2：5'-GGCCCGGACGGCGCG-3'，和
通用反向引物：5'-CGGGAGGCGCTGAAGAGGAA-3'。


2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述Badh2基因第2外显子处发生了7bp的碱基缺失，该位置位于基因转录起始密码子下游304bp到310bp之间，缺失序列为GGCGCCG。


3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，正向引物1的5'端带有FAM荧光信号标签，序列为：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'。


4.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，正向引物2的5'端带有HEX荧光信号标签，序列为：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。


5.权利要求1-4中任一项所述分子标记在快速检测水稻香味基因Badh2-E2中的应用。


6.一种快速检测水稻香味基因Badh2-E2的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)提取水稻植株基因组DNA；
(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫影，吴书俊，张丽霞，王凯，胡泽军，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31