一种快速止血CHI-HA/SH制造技术

本发明专利技术提供一种CHI‑HA/SH

【技术实现步骤摘要】
一种快速止血CHI-HA/SH4-PEG水凝胶的制备及应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种快速止血CHI-HA/SH4-PEG水凝胶的制备及应用。
技术介绍
生活上的突发性事故以及外科手术都有可能造成急性出血，如果不采取有效的止血措施，在短时间内出血量超过人体血液的40％时，可能会危及生命。因此快速有效地控制出血可以及时挽救患者的生命。现有的局部止血剂，例如纤维蛋白胶和胶原蛋白胶、水凝胶止血材料等，在其使用范围上有一定的局限性，无法完全令使用者满意。纤维蛋白胶和胶原蛋白胶具有良好的生物相容性，不易引发炎症和异物反应，但此类止血胶湿粘附能力差，凝胶强度低，机械性能不足，固化时间长，在急速大出血时会失效，无法满足失血量过大时的急救止血需求。水凝胶类止血材料通常会引入金属离子作为交联剂，导致此类止血材料细胞相容性较差，且止血所需时间较长(超过10min)，湿粘附性能差，不符合快速控制出血的要求。总之，目前缺乏同时拥有止血速度快，止血效率高，机械强度大，湿粘附能力强，生物相容性良好的生物止血材料。现有技术存在的问题：现有的止血材料止血速度慢，止血效果差，生物相容性差。
技术实现思路
本专利技术要解决的关键技术问题在于提供一种应用于快速止血的水凝胶的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：1.一种CHI-HA/SH4-PEG凝胶的制备方法，包括：(1)透明质酸溶解：称取500mg透明质酸溶于100mL去离子水中，终浓度为0.5％(w/v)。(2)CHI-HA合成反应：室温搅拌直至透明质酸完全溶解后加入287.5mgNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和479.5mgEDC(乙基(3-(二甲胺基)丙基)碳二亚胺盐酸盐)，透明质酸与EDC摩尔比为1.5:1，与NHS的摩尔比为1:1，室温搅拌1h后加入718mg盐酸多巴胺，与透明质酸的摩尔比为1.5:1。室温搅拌反应24h，反应过程中通入氮气。(3)透析干燥：反应结束后透析48h，透析液为去离子水，每2h换1次透析液。透析结束后冷冻干燥即得，-4℃贮藏备用。(4)CHI-HA溶解：将CHI-HA冻干样品溶于PBS溶液(pH5.8)中，浓度为3wt％。充分溶解后5000r/min离心20min去除气泡。(5)CHI-HA/SH4-PEG合成反应：室温下取500μL样品置于玻璃板上，分别加入不同浓度的SH4-PEG(125、250、500mg/ml)40μL搅拌均匀，滴入NaOH(0.1M)调节凝胶pH为7.5，搅拌均匀，放置60s左右形成水凝胶。2.一种CHI-HA/SH4-PEG凝胶，采用如前述方法制得，其具有如下特点：(1)水凝胶超微结构观察将上述制备的水凝胶转入24孔板中固定形状，-80℃放置10h后真空冷冻干燥。冷冻干燥后水凝胶呈蓬松状，在干燥环境下用刀片快速切成薄片(厚度为1mm左右)，粘贴固定在观察盒上喷金，在S-3400型电子显微镜5kV下进行观察，结果如图5所示。水凝胶的孔径大小能够反应交联的程度。孔径越大，交联程度越低，水凝胶的机械强度越差；反之孔径越小，交联程度越高，水凝胶的机械强度越大。随着SH4-PEG浓度的增加，CHI-HA/SH4-PEG凝胶孔径越来越小，反映出凝胶交联程度增加。其中，SH4-PEG500的机械性能最强。(2)水凝胶流变特性用流变仪(HR-1，TA，美国)测定水凝胶流变学性能。试验夹具为不锈钢圆形平板(Φ20mm)，测定温度为25℃。清理检测台，放置上述制备的水凝胶，为确保测量结果在流体的线性粘弹性区域中，以设置为1rad/s的频率执行动态应力扫描，检测弹性模量(G')和粘性模量(G”)的大小和变化情况。结果如图6～7所示。3组凝胶的弹性模量(G')均大于各自的粘性模量(G”)，表现出凝胶的典型特性；3组的弹性模量(G')和粘性模量(G”)曲线均在0.1％～10％的应变范围内保持平行，说明该范围内胶体结构保持稳定，该凝胶能够保持结构完整且胶体没有被破坏。在弹性范围内，随着SH4-PEG浓度的增加，CHI-HA/SH4-PEG凝胶的弹性模量(G')增加，最大为CHI-HA/SH4-PEG500凝胶，达到2195.22Pa；随着SH4-PEG浓度的增加，CHI-HA/SH4-PEG凝胶的粘性模量(G”)增加，最大为CHI-HA/SH4-PEG500凝胶，达到745.41Pa；该结果反应CHI-HA/SH4-PEG500凝胶具有较高的凝胶强度和较强的粘度，具备良好的止血材料的性能。3.一种CHI-HA/SH4-PEG凝胶对动物皮肤湿粘附性的测定方法和应用，包括：使用质构仪(TMS-Pro，FTC，美国)测量水凝胶对动物皮肤的湿粘附能力。新鲜的猪皮肤去除多余的脂肪后切成15mm×25mm的矩形，浸入PBS缓冲液中保持猪皮肤湿润。试验时取出猪皮，将上述制备的水凝胶(200μL)摊铺在面积为15mm×15mm的湿润猪皮肤上，另一张猪皮肤迅速覆盖，室温放置1h后测定粘附力的大小。测量期间的拉伸速率设置为5mm/min，用最大载荷除以覆盖面积计算出粘合强度，每组重复5个，结果如图8所示。随着SH4-PEG浓度的增加，CHI-HA/SH4-PEG凝胶对猪皮的湿粘附力增加，最大为CHI-HA/SH4-PEG500凝胶，达到11.28kPa。该结果反应CHI-HA/SH4-PEG500凝胶具有较强的湿粘附能力，具备良好的止血材料的性能。5.一种CHI-HA/SH4-PEG凝胶生物相容性测定方法和应用，包括：(1)称取5mg上述制备的水凝胶于超净工作台紫外灭菌30min，每组分别加入含有胎牛血清(10％，v/v)，青霉素(100单位/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基2.5mL，37℃浸提24h，浸提液经过0.22μm滤膜过滤除菌。(2)选用对数期生长状态良好的大鼠L929细胞，用胰蛋白酶进行消化后用DMEM培养基(10％胎牛血清)稀释为3×104个/mL，接种至96孔板中，每孔接种100μL。在37℃、5％CO2培养箱中培养24h。弃去96孔板中的培养液，每孔加入100μL浸提液，每组设置4个平行。(3)细胞培养板置于37℃的细胞培养箱中培养，在分别培养24、48、72h后，每孔加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，37℃孵育4h，弃除每孔的培养液，加入10％SDS，酶标仪测定570nm处的吸光值，记录。6.一种CHI-HA/SH4-PEG凝胶止血性能评价方法和止血的应用。与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：1.开发了以DOPA为功能基团的高分子化合物(CHI-HA)成为新型防水水凝胶的组分。2.选用SH4-PEG为交联剂，与DOPA基于迈克尔加成反应形成水凝胶。由于其分子量大，且比普通的巯基高聚物巯基含量高，成胶只需要60s左右，可以用作快速止血材料。3.首次合成的CHI-HA/SH4-PEG水凝胶，同时具有止血速度快，止血效率高，机械强度大，湿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CHI-HA/SH

【技术特征摘要】
1.一种CHI-HA/SH4-PEG凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
(1)透明质酸溶解：称取500mg透明质酸溶于100mL去离子水中，终浓度为0.5％；
(2)CHI-HA合成反应：室温搅拌直至透明质酸完全溶解后加入287.5mgNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和479.5mgEDC(乙基(3-(二甲胺基)丙基)碳二亚胺盐酸盐)，透明质酸与EDC摩尔比为1.5:1，与NHS的摩尔比为1:1，室温搅拌1h后加入718mg盐酸多巴胺，与透明质酸的摩尔比为1.5:1；室温搅拌反应24h，反应过程中通入氮气。
(3)透析干燥：反应结束后透析48h，透析液为去离子水，每2h换1次透析液。透析结束后冷冻干燥即得，-4℃贮藏备用；
(4)CHI-HA溶解：将CHI-HA冻干样品溶于PBS溶液中，浓度为3wt％，充分溶解后5000r/min离心20min去...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪丹丹，钟源，陈树帆，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62