干细胞活性因子及其冻干粉剂制造技术

本发明专利技术公开了干细胞活性因子及其冻干粉剂，首先提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养。通过采用本发明专利技术方法制备的干细胞活性因子及其冻干粉剂，不仅其制备方法简便，而且细胞来源具有均质性，符合干细胞的生物学特性，从而保证了干细胞源性活性因子的分泌量，及性能稳定性，并结合保湿锁水的透明质酸和甘油使得冻干粉溶解，直接作用于皮肤，已达到激活细胞功能，方便对肌肤进行修复，其修复效果好，使用方便，可快速对受损肌肤进行修复，达到抵抗肌肤衰老，修复肌肤屏障的目的，达到美容养颜，逆转时光，挽留青春的作用。

【技术实现步骤摘要】
干细胞活性因子及其冻干粉剂
本专利技术涉及干细胞活性因子
，具体为干细胞活性因子及其冻干粉剂。
技术介绍
在人体内，干细胞是一类保持未分化状态、具有高度自我更新和多项分化潜能的细胞，是机体所有功能细胞的祖宗细胞，在人体的发育及发育成熟后组织器官的维护中起重要作用，干细胞除了能分化为组织细胞修复组织损伤外，还有一个更重要的再生医学功能就是旁分泌细胞因子进行组织修复，如分泌神经细胞营养因子、促血管新生因子、造血支持因子、免疫调节因子、抗凋亡因子和趋化因子等，但是现有的干细胞活性因子提取方法只去除了部分杂质，但是糖类等杂质仍未除掉，并且还导致细胞因子大量损失，修复效果不佳，实际应用价值较低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供干细胞活性因子及其冻干粉剂，具备应用价值高的优点，解决了现有的干细胞活性因子提取方法只去除了部分杂质，但是糖类等杂质仍未除掉，并且还导致细胞因子大量损失，修复效果不佳，实际应用价值较低的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：干细胞活性因子及其冻干粉剂，包括如下步骤：（一）干细胞活性因子的提取：A、提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；B、当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备；C、当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格；D、细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠；E、将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液。（二）冻干粉剂的制备：A、将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用；B、选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液；C、将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min；D、将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂；E、将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。优选的，所述步骤一中流式检测标志物结果中显示细胞具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。优选的，所述步骤一中超声破碎仪破碎细胞时，其程序为：4～6°C，500w，超声2～3秒，间隔8秒，86个循环。优选的，所述步骤一中脐带选取后，需要对其进行清洗，清洗后的脐带组织剪成4～5cm的小段，清洗一次，然后在清洗液中剥离脐带组织中的血管和表皮，然后将华通氏胶撕成小块，清洗后于50ml离心管中剪碎，然后将组织碎块转移至125～150ml储液瓶中，加入1～2倍体积的组织消化液，于37～40°C振荡培养箱中消化1.5～3小时，直至无成形组织块，进行细胞培养。优选的，所述步骤一中的清洗液选用0.9％的生理盐水，所述培养基含有酚红。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：通过采用本专利技术方法制备的干细胞活性因子及其冻干粉剂，不仅其制备方法简便，而且细胞来源具有均质性，符合干细胞的生物学特性，从而保证了干细胞源性活性因子的分泌量，及性能稳定性，并结合保湿锁水的透明质酸和甘油使得冻干粉溶解，直接作用于皮肤，已达到激活细胞功能，方便对肌肤进行修复，其修复效果好，使用方便，可快速对受损肌肤进行修复，达到抵抗肌肤衰老，修复肌肤屏障的目的，达到美容养颜，逆转时光，挽留青春的作用。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供一种技术方案：干细胞活性因子及其冻干粉剂，包括如下步骤：（一）干细胞活性因子的提取：A、提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；B、当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备；C、当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格；D、细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠；E、将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液。（二）冻干粉剂的制备：A、将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用；B、选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液；C、将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：包括如下步骤：/n干细胞活性因子的提取：/n提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；/n当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备；/n当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格；/n细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠；/n将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；/n（二）冻干粉剂的制备：/nA、将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用；/nB、选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液；/nC、将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min；/nD、将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂；/nE、将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。/n...

【技术特征摘要】
1.干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：包括如下步骤：
干细胞活性因子的提取：
提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；
当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备；
当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格；
细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠；
将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
（二）冻干粉剂的制备：
A、将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用；
B、选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液；
C、将上述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈清法，毛文哲，杨璐，
申请(专利权)人：深圳市先康达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44