用于制备纤维蛋白基质的方法和试剂盒技术

本文描述了用于制备包含融合肽的纤维蛋白基质的方法。在一些实施方案中，该方法包括提供三种不同的组分，包括包含纤维蛋白原或纤维蛋白原前体和任选的转谷氨酰胺酶或转谷氨酰胺酶前体的第一组分，包含凝血酶或凝血酶前体的第二组分，和包含融合肽的第三组分。在这些实施方案中，第一组分和第二组分均不包含融合肽。在一些实施方案中，将第一或第二组分与第三组分预混合。混合第一、第二和第三组分以形成包含共价连接的融合肽的纤维蛋白基质。混合在不超过5天的时间范围内进行。本文还描述了用于制备包含共价连接的融合肽的纤维蛋白基质的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备纤维蛋白基质的方法和试剂盒本专利技术涉及用于制备具有融合肽的纤维蛋白基质的方法和试剂盒，并且涉及具有融合肽的纤维蛋白基质。纤维蛋白封闭剂，例如ARTISS或均来自BaxterHealthcareAG，是用于组织修复的已知产品。和由两种组分组成，在施加前即刻或施加期间混合。一种组分包含纤维蛋白原、凝血因子XIII和抑肽酶，而另一种组分包含凝血酶。混合两种组分时，凝血酶一方面裂解纤维蛋白原，从而形成纤维蛋白聚合物，另一方面活化凝血因子XIII以形成凝血因子XIIIa，凝血因子XIIIa是转谷氨酰胺酶，其交联纤维蛋白聚合物以形成固体纤维蛋白基质。纤维蛋白基质是其中纤维蛋白原被凝血酶裂解并且得到的纤维蛋白聚合物在钙源和凝血因子XIIIa的存在下交联以形成三维网络的过程的产物。已知某些生物活性因子可促进骨修复。甲状旁腺激素(PTH)是由甲状旁腺产生和分泌的84个氨基酸的肽。这种激素通过作用于各种组织，特别是骨，在控制血清钙水平方面起主要作用。这使得PTH在治疗骨疾病方面特别令人关注。已经采取方法使纤维蛋白封闭剂ARTISS或与PTH组合。例如，US8034618B2描述了含有PTH的融合蛋白与纤维蛋白原或凝血酶溶液的混合，在本申请中被称为“预混合”。为了形成纤维蛋白基质，在室温下将含有融合蛋白和纤维蛋白原的稀释的前体溶液注入到含有凝血酶的第二前体溶液中。然后将混合物施加到骨疾病的位点并形成纤维蛋白基质。生物活性因子PTH从基质中释放出来，并局部地触发骨组织的再生。令人惊讶地发现，在室温下，在纤维蛋白原溶液中的包含PTH的融合肽在相对短的时间段内降解(实施例1)。这尤其令人惊讶，因为ARTISS和的纤维蛋白原溶液均含有抑肽酶。预期抑肽酶将阻止化合物的任何蛋白水解。然而，观察到，在室温下将融合肽暴露于纤维蛋白原溶液超过5天导致包含PTH的融合肽显著降解。由于降解发生在组织封闭剂的工业制备通常所需的时间范围内，因此在上述现有技术中用于制备包含融合肽的纤维蛋白基质的方法在再现性和一致性方面存在严重缺陷。因此，这是本专利技术的目的。因此，本专利技术的目的是克服现有技术的缺点。更特别地，本专利技术的目的是提供用于制备作为封闭剂的纤维蛋白基质的方法，该方法更具再现性和一致性。这些目的已经通过如下所述的用于制备纤维蛋白基质的方法和试剂盒得以解决。本文描述了用于制备包含融合肽的纤维蛋白基质的方法。在一些实施方案中，该方法包括提供三种不同的组分，包括包含纤维蛋白原或纤维蛋白原前体和任选的转谷氨酰胺酶或转谷氨酰胺酶前体的第一组分，包含凝血酶或凝血酶前体的第二组分，和包含融合肽的第三组分。在这些实施方案中，第一组分和第二组分均不包含融合肽。在一些实施方案中，将第一或第二组分与第三组分预混合。混合第一、第二和第三组分以形成包含共价连接的融合肽的纤维蛋白基质。混合在不超过5天的时间范围内进行。本文还描述了用于制备包含共价连接的融合肽的纤维蛋白基质的试剂盒。I.用于制备纤维蛋白基质的方法公开了用于制备包含融合肽的纤维蛋白基质的方法。该方法包括第一步骤(i)：提供包含纤维蛋白原或纤维蛋白原前体和转谷氨酰胺酶如凝血因子XIIIa或转谷氨酰胺酶前体如凝血因子XIII的第一组分，和第二步骤(ii)：提供包含凝血酶或凝血酶前体的第二组分。第一组分和第二组分均不包含融合肽，所述融合肽包含第一结构域和在第二结构域中的可共价交联的转谷氨酰胺酶底物结构域。该方法进一步包括第三步骤(iii)：提供第三组分，该第三组分包含融合肽，所述融合肽包含第一结构域和在第二结构域中的可共价交联的转谷氨酰胺酶底物结构域。第三组分不包含纤维蛋白原或纤维蛋白原前体，也不包含凝血酶或凝血酶前体。在该方法的另外的第四步骤(iv)中，通过混合第一、第二和第三组分形成包含共价连接的融合肽的纤维蛋白基质。三种组分的混合在不超过5天，优选地2至3天，最优选地1天的时间范围内进行。任选地，在甚至少于1天，例如在10小时、5小时、4小时、3小时或2小时之内；在少于60分钟内，例如在30分钟、20分钟、10分钟或5分钟之内；或甚至在少于60秒内，例如在40秒、30秒、20秒、10秒或5秒之内的时间范围内，将三种组分混合在一起。任选地，在不超过5天，优选地不超过2天，最优选地不超过1天的时间范围内，将第二组分加入到第一组分和第三组分的混合物中，或者将第一组分加入到第二组分和第三组分的混合物中。例如，可以将第一组分(如包含纤维蛋白原或纤维蛋白原前体和转谷氨酰胺酶或转谷氨酰胺酶前体)和第三组分(包含融合肽)混合在一起，然后储存最多5天，优选地最多2至3天，和最优选地最多1天，然后与第二组分(包含凝血酶或凝血酶前体)混合。同样地，可以将第二组分(包含凝血酶或凝血酶前体)和第三组分(包含融合肽)混合在一起，然后储存最多5天，优选地最多2至3天，和最优选地最多1天，然后与第一组分(如包含纤维蛋白原或纤维蛋白原前体和转谷氨酰胺酶或转谷氨酰胺酶前体)混合。在其中在步骤(iv)中将第一和第二组分混合在一起的实施方案中，优选地在混合第一和第二组分时或在混合第一和第二组分后不超过一天，优选地在1小时内，优选地在5分钟内，优选地在1分钟内，最优选地在30秒内的时间范围内将第三组分加入到混合物中。在该实施方案中，取决于给药方法，在混合三种组分开始的五天内将三种组分的混合物给予患者。在一些实施方案中，使用连接装置混合组分。通过在连接装置中混合或者允许通过连接装置将两种或多种组分转移到单个容器中，可以使用连接装置来实现两种或三种组分的混合。在一些实施方案中，纤维蛋白基质在身体内或身体上原位形成。在其他实施方案中，基质可以在身体外部形成，然后以预成形的形状施加。在这两种情况下，将基质施加或植入到需要治疗的部位。两种预混合的组分可以在双隔室装置的一个隔室中，而其余的组分可以在该装置的第二隔室中，优选地，这些隔室通过连接装置附接。包含两个或更多个隔室的装置可以用与该装置中隔室数量相同数量的单独的容器替换，并可以与本文所述的多隔室装置相同的方式使用。两种组分可以位于双隔室装置(或两个容器)中，并且其余组分可以位于第三隔室(或第三容器)中。双隔室装置的两种组分通过连接装置混合，所述连接装置然后连接第三隔室，从而导致三种组分的混合。优选地，双隔室和第三隔室通过连接装置连接。连接装置可以是单独的装置，或者可以是双隔室装置的部分或第三隔室的部分。任选地，可以通过将第三隔室附接到第四隔室并且在第三和第四隔室之间来回转移混合物来进一步混合这三种组分。第三隔室和第四隔室可以通过连接装置附接(例如，参见图2E)。这三种组分可以位于单独的隔室中，并且可以通过附接到三通连接装置同时混合，也可以在三隔室注射器中混合。优选地，三个隔室连接到连接装置(例如，参见图2A-2D和4B-4C)，或者具有作为三个单独隔室之一的部分的连接装置，或者具有作为三隔室注射器的部分的连接装置。供选择地，这三种组分在三个独立的隔室中。在第一步中，将三种组分中的两种混合，并且在第二步中，将该混合物与剩余的组分混合(参见例如图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于形成包含融合肽的纤维蛋白基质的方法，其中所述方法包括以下步骤：/ni)提供包含纤维蛋白原或纤维蛋白原前体和转谷氨酰胺酶(TG)或转谷氨酰胺酶前体的第一组分；/nii)提供包含凝血酶或凝血酶前体的第二组分；/n其中所述第一组分和第二组分均不包含融合肽，所述融合肽包含第一结构域和在第二结构域中的可共价交联的转谷氨酰胺酶底物结构域；/niii)提供包含所述融合肽的第三组分，其中所述第三组分不包含纤维蛋白原、纤维蛋白原前体、凝血酶或凝血酶前体；/niv)混合所述第一、第二和第三组分；/n其中步骤(iv)在不超过5天，优选地不超过3天，不超过2天，或1天期间的时间范围内进行。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180316 EP 18162280.4;20180309 US 62/6408141.一种用于形成包含融合肽的纤维蛋白基质的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)提供包含纤维蛋白原或纤维蛋白原前体和转谷氨酰胺酶(TG)或转谷氨酰胺酶前体的第一组分；
ii)提供包含凝血酶或凝血酶前体的第二组分；
其中所述第一组分和第二组分均不包含融合肽，所述融合肽包含第一结构域和在第二结构域中的可共价交联的转谷氨酰胺酶底物结构域；
iii)提供包含所述融合肽的第三组分，其中所述第三组分不包含纤维蛋白原、纤维蛋白原前体、凝血酶或凝血酶前体；
iv)混合所述第一、第二和第三组分；
其中步骤(iv)在不超过5天，优选地不超过3天，不超过2天，或1天期间的时间范围内进行。


2.权利要求1所述的方法，其中所述融合肽包含在所述第一结构域中的PTH。


3.权利要求2所述的方法，其中PTH选自PTH1-84、PTH1-38、PTH1-34、PTH1-31和PTH1-25。


4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一组分或所述第二组分还包含钙离子源。


5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，以0.01至2mg/mL纤维蛋白基质的浓度范围添加所述融合肽。


6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一组分包含转谷氨酰胺酶前体，并且其中所述转谷氨酰胺酶前体是凝血因子XIII。


7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述融合肽还包含在所述第一和第二结构域之间的降解位点。


8.权利要求7所述的方法，其中所述降解位点是酶切割位点。


9.权利要求8所述的方法，其中所述酶切割位点是纤溶酶切割位点。


10.权利要求1至9中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·沃格特，A·S·伊尔文，P·索丹，
申请(专利权)人：库罗斯生物外科股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH