一种解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白用发酵液及其发酵方法技术

本发明专利技术公开一种解淀粉芽孢杆菌SZ‑60产胞外抑菌蛋白胞外蛋白用发酵液及其发酵方法。发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉10‑20g，黄豆粉10‑20g，NaCl 2‑7g，MnSO

【技术实现步骤摘要】
一种解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白用发酵液及其发酵方法
本专利技术属于解淀粉芽孢杆菌SZ-60胞外抑菌蛋白的发酵工艺
，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外蛋白用发酵液及其发酵方法。
技术介绍
人参(PanaxginsengMeyer)为五加科人参属多年生宿根药用植物，在中国、韩国、俄罗斯、朝鲜等国家有大面积种植。中国东北地区是中国人参的主产区，在长白山麓地区有大面积种植。由于地理位置特殊，由灰葡萄孢BotrytiscinereaPers.exFr.引起的人参灰霉病频发。目前，防治人参灰霉病仍以化学防治为主，通过施用代森锰锌、腐霉利等控制病情蔓延，但长期大面积使用化学农药会造成病害抗药性、土壤农残、土壤微生态失衡等一些问题。生物防治办法可减少或抑制人参病害的发生，且具有绿色安全、高效等特点，因此，是目前最为理想的防治途径之一，也是植物病害防治的主要研究方向。研究发现，内生细菌NJ13菌株发酵液对人参黑斑病具有防治作用；分离自人参根围土壤的芽孢杆属(Baclliusspp.)菌株可用于防治腐皮镰孢菌Fusariumsolani(mart.)App.etWollenw引起的人参根腐病和恶疫霉Phytophthoracactorum引发的人参疫病。关于利用生防细菌防治植物真菌性病害，如何有效地提高其产胞外抑菌物质的能力是提高其生防效力的关键。有研究者证实，芽孢杆菌通过核糖体及非核糖体合成途径产生的抑菌蛋白具有直接杀死或抑制病原物生长、与病原菌进行营养和空间的竞争及诱导植物产生抗病性的作用。目前，芽胞杆菌发酵的常用培养基主要成分有黄豆饼粉、小麦粉、玉米糊、鱼粉和酵母膏(粉)以及一些微量元素等。针对不同的菌株，培养基组分的不同可对发酵液菌含量及抑菌物质合成积累产生较大影响。通过优化解淀粉芽胞杆菌Lx-11的发酵培养基，张荣胜等(解淀粉芽胞杆菌Lx-11生物发酵工艺优化，2013，29(2)：254-262)发现菌株发酵液的菌含量、抑菌效果分别提高了180％和30％；研究发现，发酵培养基中豆粕含量的高低对枯草芽孢杆菌NJ-18的菌含量和抑菌活性存在较大的影响；张文芝等(蜡质芽孢杆菌AR156发酵培养基及发酵条件的优化，2010，37(6)：803-810)研究发现，碳、氮源以及无机盐含量的变化对提高蜡质芽孢杆菌Bacilluscereus产胞外抑菌物质的能力有利。解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensSZ-60是专利技术人课题组前期分离获得的一株对人参灰霉病等真菌性病害具有良好防治效果的生防细菌。该菌株现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏编号为CGMCCNo.8277)，并拥有名称为“一种解淀粉芽孢杆菌及其应用”、授权公告号为CN103789234B的专利技术专利。为了进一步提高解淀粉芽孢杆菌SZ-60微生物制剂中抑菌蛋白的含量，亟需对解淀粉芽孢杆菌SZ-60产抑菌蛋白的发酵方法进行优化。
技术实现思路
本专利技术提供一种发酵培养液，所述发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉10-20g，黄豆粉10-20g，NaCl2-7g，MnSO42-7mg，Ca(HCO3)25-15mg，FeSO41-4mg。例如，所述发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉12-18g，黄豆粉12-18g，NaCl3-6g，MnSO43-6mg，Ca(HCO3)27-13mg，FeSO41.5-3mg。示例性地，所述发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉15.0g，黄豆粉15.0g，NaCl5.0g，MnSO45.0mg，Ca(HCO3)210.0mg，FeSO42.0mg。根据本专利技术，所述发酵培养液的pH为6.5-7.5，例如为6.7-7.2，示例性为7.0。根据本专利技术的实施方案，所述发酵培养液每1000mL去离子水含有可溶性淀粉15.0g，黄豆粉15.0g，NaCl5.0g，MnSO45.0mg，Ca(HCO3)210.0mg，FeSO42.0mg，pH7.0。本专利技术还提供上述发酵培养液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：按上述用量称取可溶性淀粉、黄豆粉、NaCl、MnSO4、Ca(HCO3)2以及FeSO4，放入去离子水中加热溶解混匀，调整混合液的pH至6.5-7.5，湿热灭菌后冷却备用。根据本专利技术，所述湿热灭菌的温度为115-125℃，例如118-123℃，示例性为121℃。进一步地，所述湿热灭菌的时间为10-60min，例如20-50min，示例性为30min。根据本专利技术，所述发酵培养液的制备方法包括如下步骤：以1000mL去离子水计，将可溶性淀粉12-18g，黄豆粉12-18g，NaCl3-6g，MnSO43-6mg，Ca(HCO3)27-13mg，FeSO41.5-3mg，放入去离子水中加热溶解，充分搅拌混合均匀，调整混合液的pH至6.7-7.2，于118-123℃湿热灭菌20-50min，冷却备用。根据本专利技术示例性的实施方案，所述发酵培养液的制备方法包括如下步骤：以1000mL去离子水计，将可溶性淀粉15.0g，黄豆粉15.0g，NaCl5.0g，MnSO45.0mg，Ca(HCO3)210.0mg，FeSO42.0mg，放入去离子水中加热溶解，充分搅拌混合均匀，调整混合液的pH至7.0，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，冷却后立即接种。本专利技术还提供上述发酵培养液在解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白中的应用。其中，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60的保藏号为CGMCCNo.8277。本专利技术还提供一种解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白的发酵方法，包括如下步骤：(1)将解淀粉芽孢杆菌SZ-60菌种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后挑取单一菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，培养后，从得到的细菌培养液中分离出菌体，将所得菌体制成含菌量为108CFU/mL数量级的细菌悬液备用；(2)吸取步骤(1)所述细菌悬液，接种于NBYM发酵液中，培养至发酵液菌体生长较为饱满即将出现芽孢时，得到发酵种子液；(3)将步骤(2)所述发酵种子液接种于发酵培养液中，培养得到解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液；所述发酵培养液具有如上文所述的含义。根据本专利技术，步骤(1)中，所述牛肉膏蛋白胨培养基中每含1000mL去离子水时，其含有牛肉膏2.5-3.5g、蛋白胨7-15g、NaCl3-8g，琼脂12-20g。例如，所述牛肉膏蛋白胨培养基中每含1000mL去离子水时，其含有牛肉膏2.8-3.2g、蛋白胨8-12g、NaCl4-7g，琼脂14-18g。示例性地，所述牛肉膏蛋白胨培养基中含有牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g，琼脂16.0g，去离子水1000mL。进一步地，所述牛肉膏蛋白胨培养基的pH为6.5-7.2，例如为6.8-7.0。根据本专利技术，步骤(1)中，所述牛肉膏蛋白胨培养基的制备过程包括：按照上述用量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵培养液，其特征在于，所述发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉10-20g，黄豆粉10-20g，NaCl 2-7g，MnSO

【技术特征摘要】
1.一种发酵培养液，其特征在于，所述发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉10-20g，黄豆粉10-20g，NaCl2-7g，MnSO42-7mg，Ca(HCO3)25-15mg，FeSO41-4mg；
优选地，所述发酵培养液的pH为6.5-7.5。


2.权利要求1所述的发酵培养液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
按权利要求1所述用量称取可溶性淀粉、黄豆粉、NaCl、MnSO4、Ca(HCO3)2以及FeSO4，放入去离子水中加热溶解混匀，调整混合液的pH至6.5-7.5，湿热灭菌后冷却备用；
优选地，所述湿热灭菌的温度为115-125℃；
优选地，所述湿热灭菌的时间为10-60min。


3.权利要求1所述发酵培养液在解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白中的应用。


4.一种解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括如下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌SZ-60菌种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后挑取单一菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，培养后，从得到的细菌培养液中分离出菌体，将所得菌体制成含菌量为108CFU/mL数量级的细菌悬液备用；
(2)吸取步骤(1)所述细菌悬液，接种于NBYM发酵液中，培养至发酵液菌体生长较为饱满即将出现芽孢时，得到发酵种子液；
(3)将步骤(2)所述发酵种子液接种于发酵培养液中，培养得到解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液；
所述发酵培养液具有如权利要求1所述的含义。


5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，步骤(1)中，所述牛肉膏蛋白胨培养基中每含1000mL去离子水时，其含有牛肉膏2.5-3.5g、蛋白胨7-15g、NaCl3-8g，琼脂12-20...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙卓，杨利民，韩梅，韩忠明，程林，吕泽良，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22