感兴趣的蛋白质的展示系统技术方案

本文描述一种蛋白质展示选择方法，其将感兴趣的蛋白质(POI)文库与展示选择系统解偶联。POI的展示可以通过表达后POI和锚蛋白之间形成共价键来实现，所述共价键可以通过酶促蛋白连接(例如SpyLigase、SnoopLigase、分选酶、蝶豆粘酶、肽基连接酶等)或自发的共价键形成(例如SpyTag/SpyCatcher，SnoopTag/SnoopCatcher等)来实现。对于最常见的噬菌体展示形式，POI文库在POI的C端融合至系连序列(例如SpyTag)，然后与锚蛋白(例如，SpyCatcher融合的锚蛋白，例如SpyCatcher‑基因III蛋白(SpyCatcher‑pIII)融合体)上的捕获序列形成共价键。本文还提供了核酸构建体、宿主细胞系统和产生蛋白质展示系统的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】感兴趣的蛋白质的展示系统此申请的序列表被记为“Seq-List.txt”，其于2019年4月1日创建，大小为70KB。序列表的全部内容通过引用整体并入本文。
技术介绍
噬菌体展示从大型文库中选择具有特定特性的蛋白质是一个熟知的过程。噬菌体展示是最古老、最常用的选择方法。它基于感兴趣的蛋白质(POI)在包含POI(例如抗体)相应DNA的噬菌体表面上的呈递。对于噬菌体展示，POI与噬菌体包衣蛋白共价连接。最常见的是，使用与丝状噬菌体M13的基因III蛋白(pIII)的遗传融合体，但文献中也有与其他包衣蛋白的融合体。通常将POI-pIII融合体克隆到噬菌粒载体中，该载体包含抗生素抗性标志物、噬菌体和细菌DNA聚合酶的复制起点以及用于将噬菌粒包装入噬菌体的噬菌体形态发生信号(Qi等，2012)。噬菌体生产的缺失基因是通过感染辅助噬菌体(一种带有突变包装信号的全长噬菌体)来提供的。由于这种突变，被包装到噬菌体包衣中的主要是噬菌粒而不是辅助噬菌体DNA。这些噬菌体通常在表面上仅包含一个POI-pIII融合体，因为来自辅助噬菌体的野生型pIII的掺入比来自噬菌粒的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种载体的组合，包括：/na)第一载体，其包含包括编码在框内与系连序列融合的感兴趣的蛋白质(POI)的多核苷酸的遗传构建体(GC1)；和/nb)第二载体，其包含包括编码在框内与捕获序列融合的锚蛋白的多核苷酸的遗传构建体(GC2)，/n系连序列和捕获序列当自发地或借助于酶相互接触时形成共价键，或一种载体的组合，包括：/na)第一载体，其包含包括编码在框内与捕获序列融合的感兴趣的蛋白质(POI)的多核苷酸的遗传构建体(GC1)；和/nb)第二载体，其包含包括编码在框内与系连序列融合的锚蛋白的多核苷酸的遗传构建体(GC2)，/n系连序列和捕获序列当自发地或借助于酶相互接触时形成共价键。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180405 US 62/652,9381.一种载体的组合，包括：
a)第一载体，其包含包括编码在框内与系连序列融合的感兴趣的蛋白质(POI)的多核苷酸的遗传构建体(GC1)；和
b)第二载体，其包含包括编码在框内与捕获序列融合的锚蛋白的多核苷酸的遗传构建体(GC2)，
系连序列和捕获序列当自发地或借助于酶相互接触时形成共价键，或一种载体的组合，包括：
a)第一载体，其包含包括编码在框内与捕获序列融合的感兴趣的蛋白质(POI)的多核苷酸的遗传构建体(GC1)；和
b)第二载体，其包含包括编码在框内与系连序列融合的锚蛋白的多核苷酸的遗传构建体(GC2)，
系连序列和捕获序列当自发地或借助于酶相互接触时形成共价键。


2.如权利要求1所述的载体的组合，其中，每个载体包含用于表达POI和锚蛋白的转录或翻译控制序列。


3.如权利要求1所述的载体的组合，其中，所述转录或翻译控制序列选自复制起点、启动子、增强子、阻遏物结合区、转录起始位点、核糖体结合位点、翻译起始位点和针对转录和翻译的终止位点。


4.如权利要求1-3中任一项所述的载体的组合，其中，所述POI选自抗体、抗体片段、单链抗体、scFv、scFab、单结构域抗体、蛋白质支架(例如基于纤连蛋白III、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、脂蛋白、锚蛋白重复结构域、蛋白A的Z结构域等)、酶、激素、白介素、用于开发疫苗的抗原、人生长激素(hGH)、N-甲硫基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素原、松弛素A链、松弛素B链、前松弛素、卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)、黄体化激素(LH)、糖蛋白激素受体、降钙素、胰高血糖素、VIII因子、肺表面活性剂、尿激酶、链激酶、人类组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、蛙皮素、IX因子、凝血酶、造血生长因子、肿瘤坏死因子-α和-β、脑啡肽酶、人血清白蛋白、穆勒氏抑制物、小鼠促性腺激素相关肽、微生物蛋白、β-内酰胺酶、组织因子蛋白、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、激素或生长因子的受体；整联蛋白、血小板生成素、蛋白A或D、类风湿因子、神经生长因子、NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I或-II、胰岛素样生长因子结合蛋白、DNA酶、潜伏期相关肽、促红细胞生成素、骨诱导因子、干扰素、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子(CSF)、M-CSF、GF-CSF和G-CSF、白介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、超氧化物歧化酶；衰变促进因子、病毒抗原、HIV包膜蛋白、GP120、GP140、心房利钠肽A、B或C。


5.如权利要求1-4中任一项所述的载体的组合，其中，所述系连序列选自：选自SEQIDNO：1、3、5、6、25或27中的任一项的SpyTag序列，与SEQIDNO：1、3、5、6、25或27中任一项所述的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的蛋白质，选自SEQIDNO：13、7、11、9、10或15中的任一项的SnoopTag序列，或与SEQIDNO：13、7、11、9、10或15中任一项所述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的蛋白质，分选酶识别结构域或分选酶桥接结构域，蝶豆粘酶识别基序或分裂内含蛋白。


6.如权利要求1-5中任一项所述的载体的组合，其中，所述捕获序列是选自SEQIDNO：1、3、5、6、26或yfqgamvttlsglsgeqgpsgdmtteedsathikfskrdedgrelagatmelrdssgktistwisdghvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngeatkgdaht(SEQIDNO：28)中任一项的SpyCatcher序列，与SEQIDNO：1、3、5、6、26或yfqgamvttlsglsgeqgpsgdmtteedsathikfskrdedgrelagatmelrdssgktistwisdghvkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngeatkgdaht(SEQIDNO：28)中任一项所述的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的蛋白质，选自SEQIDNO：13、7、11、9、10或15中的任一项的SnoopCatcher序列，或与SEQIDNO：13、7、11、9、10或15中任一项所述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的蛋白质，分选酶识别结构域或分选酶桥接结构域，蝶豆粘酶识别基序或分裂内含蛋白。


7.如权利要求1-6中任一项所述的载体的组合，其中，所述锚蛋白选自pIII、pVI、pVII、pVIII、pIX、细菌细胞外膜蛋白、菌毛、鞭毛、修饰的细菌脂蛋白、冰核蛋白、自转运蛋白、LamB、OmpA、Lpp-OmpA、INP、FliC、FimA、蛋白A、LysM、FnBPB、M6、SbpA、RsaA、细胞壁蛋白α-凝集素1、α-凝集素2、Cwp1、Cwp2、Gas1p、Yap3p、Flo1p、Crh2p、Pir1、Pir2、Pir4、Icwp、HpSEDI、HpGASI、HpTIPI、HPWPI、HwpIp、Als3p、Rbt5p、表面受体或GPI锚序列。


8.一种原核或真核宿主细胞，其包含如权利要求1-7中任一项所述的载体的组合。


9.如权利要求8所述的原核或真核宿主细胞，所述宿主细胞包含：包含与编码衍生自SEQIDNO：13、7、11、9、10或15的连接酶或与衍生自SEQIDNO：13、7、11、9、10或15的连接酶具有至少70％序列同一性的连接酶的多核苷酸可操作地连接的启动子的载体；包含与编码分选酶的多核苷酸可操作地连接的启动子的载体；或包含与编码蝶豆粘酶的多核苷酸可操纵地连接的启动子的载体；或者所述宿主细胞包含掺入其基因组中的启动子，所述启动子可操作地连接至：编码衍生自SEQIDNO：13、7、11、9、10或15的连接酶或与衍生自SEQIDNO：13、7、11、9、10或15的连接酶具有至少70％序列同一性的连接酶的多核苷酸；编码分选酶的多核苷酸；或编码蝶豆粘酶的多核苷酸。


10.一种在噬菌体颗粒表面展示(多)肽/蛋白质的方法，包括：引起或允许将感兴趣的蛋白质(POI)附着到所述噬菌体颗粒的蛋白质包衣中的锚蛋白上，其中所述附着是由于与所述POI融合的系连序列和与所述锚蛋白融合的捕获序列之间形成肽键所致。


11.如权利要求10所述的方法，其中，所述系连序列选自：选自SEQIDNO：1、3、5、6、25或27中的任一项的SpyTag序列，或与SEQIDNO：1、3、5、6、25或27中任一项所述的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的蛋白质，选自SEQIDNO：13、7、11、9、10或15中的任一项的SnoopTag序列，或与SEQIDNO：13、7、11、9、10或15中任一项所述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的蛋白质，分选酶识别结构域或分选酶桥接结构域，蝶豆粘酶识别基序或分裂内含蛋白。


12.如权利要求10所述的方法，其中，所述捕获序列是选自SEQIDNO：1、3、5、6、26或28中任一项的SpyCatcher序列，与SEQIDNO：1、3、5、6、26或28中任一项所述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的蛋白质，选自SEQIDNO：13、7、11、9、10或15中的任一项的SnoopCatcher序列，或与SEQIDNO：13、7、11、9、10或15中任一项所述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的蛋白质，分选酶识别结构域或分选酶桥接结构域，蝶豆粘酶识别基序或分裂内含蛋白。


13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中，所述锚蛋白选自pIII、pVI、pVII、pVIII、或pIX。


14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中，所述POI选自抗体、抗体片段、单链抗体、scFv、scFab、单结构域抗体、蛋白质支架(例如基于纤连蛋白III、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、脂蛋白、锚蛋白重复结构域、蛋白A的Z结构域等)、酶、激素、白介素、用于开发疫苗的抗原、人生长激素(hGH)、N-甲硫基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素原、松弛素A链、松弛素B链、前松弛素、卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)、黄体化激素(LH)、糖蛋白激素受体、降钙素、胰高血...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·野拉，
申请(专利权)人：生物辐射ABD瑟罗泰克有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE