一种防止RNA降解的保护方法、保护序列、组合物和试剂盒及其应用技术

一种防止RNA降解的保护方法、保护序列、组合物和试剂盒及其应用，提高对病毒RNA的保护效应。明确加入RNase AP保护序列后，目标保护的RNA的三维结构以及RNA的结构变构特性，实现对RNA完整性有较好的保护作用，实现一次性扩增即能得到高水平的检出率，确保对病毒RNA的高效富集，为后续逆转录和PCR扩增提供保障。

【技术实现步骤摘要】
一种防止RNA降解的保护方法、保护序列、组合物和试剂盒及其应用
本专利技术涉及体外核酸检测
，具体涉及一种防止RNA降解的保护方法、保护序列、组合物和试剂盒及其应用。
技术介绍
核糖核酸(RibonucleicAcid,RNA)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，RNA只有单链，不稳定，极易被RNA酶降解。RNA酶(RNase)活性非常强，自然界中存在有大量的RNA酶。为了防止RNA酶对RNA的降解，提高实验或检验过程中目的RNA的得率，研究和开发各种RNA提取技术和方法意义重大。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种防止RNA降解的保护方法、保护序列、组合物和试剂盒及其应用，进一步提高对病毒RNA的保护效应。本专利技术采用的技术解决方案是：一种防止RNA降解的保护方法，包括以下步骤：通过RNA酶保护序列(RNase-AP)与目的RNA的高效结合后形成RNA:DNA复合物，结合使得RNA暴露区域减少，从而使RNA酶不能有效切割目的RNA防止RNA降解。所述的RNA酶保护序列(RNase-AP)与目的RNA结合位置为目的RNA上的RNA酶识别位点。一种防止RNA降解的保护方法,包括以下步骤：通过RNA酶保护序列(RNase-AP)与RAN酶结合形成复合物，影响了RNA酶的活性，抑制了RNA酶与目的RNA结合的能力，防止目的RNA被降解。所述的RNA酶保护序列(RNase-AP)与RAN酶结合位置为RAN酶上的RNA酶识别位点。一种防止RNA降解的保护方法,包括以下步骤：通过RNA酶保护序列(RNase-AP)与目的RNA结合后，引起目的RNA的局部结构改变，使得RNA酶与目的RNA结合的效率降低或结合位置改变，使得RNA酶不能对目的RNA进行切割降解，防止目的RNA被降解。所述的RNA酶保护序列(RNase-AP)与目的RNA结合位置为目的RNA上的RNA酶识别位点。一种RNA酶保护序列,采用RNA酶识别位点的序列作为RNA酶保护序列。一种RNA酶保护序列在作为制备病毒检测试剂上的应用。一种病毒检测组合物，包括所述的RNA酶保护序列。一种病毒检测试剂盒，包括所述的病毒检测试剂。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种防止RNA降解的保护方法、保护序列、组合物和试剂盒及其应用，提高对病毒RNA的保护效应。明确加入RNaseAP保护序列后，目标保护的RNA的三维结构以及RNA的结构变构特性，实现对RNA完整性有较好的保护作用，实现一次性扩增即能得到高水平的检出率，确保对病毒RNA的高效富集，为后续逆转录和PCR扩增提供保障。附图说明图1为不同浓度的质粒cDNA的荧光定量检测，最低检出拷贝数1ag(15拷贝)/μl。图2为病毒cDNA:RT-PCR(15拷贝/ml)检出的重复性，1ag质粒cDNA重复10次和阴性对照重复10次，Q-PCR扩增50个循环未见假阳性。图3为病毒RNA标准品RT-PCR检测最低拷贝数为80拷贝/ml。图4为在唾液的模拟样本中加入病毒RNA标准品检测最低拷贝数为80拷贝/ml。图5为比较商业试剂盒A和商业试剂盒B在病毒RNA标准品在唾液样本中的检测效果。图6为常见细菌对COVID-19病毒RNA检测无干扰作用。图7为温医大”提取液检出的ORF基因的CT值显著低于商业提取试剂盒A提取液。图8为N基因500nt片段在AP结合前后的二级结构的示意图。图9为ORF1ab基因500nt片段在AP结合前后的二级结构的示意图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。现采用SARS-CoV-2新型冠状病毒，采用本专利技术所述的防止RNA降解的保护方法对效果进行进一步验证：(一)新型样品处理液对SARS-CoV-2病毒的有效识别和对病毒RNA的保护作用及机制。针对新型冠状病毒的目标靶点基因，设计新的RNA保护位点的引物序列。并优化样本处理液中裂解/保护各组分配比，复合试剂浓度，盐离子浓度，PH等，完善新型裂解液反应体系，进一步提高裂解液/保护液对病毒RNA的保护效应。明确加入有效保护剂后，目标保护的病毒RNA的三维结构以及病毒RNA的结构变构特性，研究本项目试剂盒中样本处理液对SARS-CoV-2病毒的有效识别和对病毒RNA的保护作用及机制。1.样品处理液的组分配比：1mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸,100mmol/LNaCl，100mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl，5mol/L盐酸胍，1％TritonX-100，0.1mg/ml蛋白酶K，0.1mg/ml硅藻土,特定设计的20nM的N基因保护序列1(anchorprimer,AP，保护序列信息详见第二部分AP-WHN-1,)和特定设计的20nM的ORF1ab1ab保护序列2(AP-WHORF1ab-1，保护序列信息详见第二部分)。2.作用机制：首先，AP与SARS-CoV-2病毒RNA结合后，引起病毒RNA的局部结构改变，使得RNA酶与病毒RNA结合的效率降低或结合位置改变，使得RNA酶不能对病毒RNA进行切割降解。其次，RNase-AP首先与SARS-CoV-2病毒RNA的高效结合后形成RNA:DNA复合物，这样的竞争结合使得RNA暴露区域减少，RNA酶不能有效切割。最后，RNase-AP可能与RAN酶结合形成复合物，这样的结合竞争抑制了与病毒RNA结合的能力，影响了RNase的活性。(二)引物/探针的特异性优化，提高试剂盒的特异性，有效减少假阳率，提高检出率；参照新型冠状病毒的结构，设计新型特异性引物/探针应对当前病毒可能出现变异的情况。通过设计有针对SARS-CoV-2病毒的ORF1ab1ab和N基因双重基因靶点的探针，同时检测，实现对靶向病毒RNA的检测的特异性。增加对ORF1ab其他区域的引物设计，实现多基因、多位点的检测，有效提高试剂盒的检出率。同时，详细分析不同类型冠状病毒同源性，结合针对2019新型冠状病毒结构生物学和生物信息学的最新研究结果，针对其高度保守区域设计新的引物探针，应对2019新型冠状病毒可能发生的变异，实现检测试剂盒的即时更新换代，确保检测准确性。通过生物信息学分析，我们首先针对SARS-CoV-2的N基因(基因坐标2889-2997,图9A)和ORF1ab1ab基因(基因坐标28548-28763,图8A)，设计了特定的保护序列，如表1所示AP-WHORF1ab-1,AP-WHN-1。表1、1.RNA与RNase-AP结合后，SARS-CoV-2病毒RNA的生物信息学的结构预测(图8B和图9B)，SARS-CoV-2病毒RNA与RNA酶的结合预测研究(图8C和图9C)。1)首先我们调用RPIseq随机森林和支持向量机算法，对保护序列与人类RNA酶的结合特性进行评价本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种防止RNA降解的保护方法,其特征在于，包括以下步骤：通过RNA酶保护序列(RNase-AP)与目的RNA的高效结合后形成RNA:DNA复合物，结合使得RNA暴露区域减少，从而使RNA酶不能有效切割目的RNA防止RNA降解。/n

【技术特征摘要】
1.一种防止RNA降解的保护方法,其特征在于，包括以下步骤：通过RNA酶保护序列(RNase-AP)与目的RNA的高效结合后形成RNA:DNA复合物，结合使得RNA暴露区域减少，从而使RNA酶不能有效切割目的RNA防止RNA降解。


2.根据权利要求1所述的一种防止RNA降解的保护方法，其特征在于，所述的RNA酶保护序列(RNase-AP)与目的RNA结合位置为目的RNA上的RNA酶识别位点。


3.一种防止RNA降解的保护方法,其特征在于，包括以下步骤：通过RNA酶保护序列(RNase-AP)与RAN酶结合形成复合物，影响了RNA酶的活性，抑制了RNA酶与目的RNA结合的能力，防止目的RNA被降解。


4.根据权利要求3所述的一种防止RNA降解的保护方法，其特征在于，所述的RNA酶保护序列(RNase-AP)与RAN酶结合位置为RAN酶上的RNA酶识别位点。


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【专利技术属性】
技术研发人员：瞿佳，徐陶，王金固，陈江帆，徐良德，
申请(专利权)人：温州医科大学附属眼视光医院，杭州拜赛思生物科技有限责任公司，温州瓯佳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33