用自旋探针对含白蛋白的样品进行ESR频谱检测的方法及实验器具技术

本发明专利技术涉及一种在医学生物学、生物工程学和兽医学实践中用于对含有白蛋白的样品的白蛋白的转移特性变化进行ＥＳＲ－频谱测定的方法，用于对人体和动物体中地热生理和病理变换进行诊断和／或控制，对含有白蛋白的制剂，尤其是血液制品的质量进行检查。本发明专利技术的主题还包括实施本发明专利技术方法的ＥＳＲ－频谱仪，该仪器作为自动分析仪使用简便可靠满足现代临床实验条件的要求，其中自动设备控制、信号寄存和与计算机程序配合进行测量数据的诊断分析的信号分析综合在一起。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种在医学、生物、生物工程和兽医学实践中应用的电子自旋共振(ESR)-频谱检测含有白蛋白的样品的白蛋白的转移特性变化的方法，该方法适用于诊断和检查人体和动物体内生理或病理的变化或用于对含有白蛋白的制剂，特别是血液制品的质量的检查。另外本专利技术的主题还包括实施本专利技术方法的ESR-频谱仪。已知在诊断疾病时必须对在临床-化学常规检查中广泛应用的血液参数或涉及抗原、激素、酶和生物活性物质等加以考虑。而且也可以应用NMR-和ESR-频谱检测血清中的蛋白-和脂肪成分的结构和功能特性进行疾病诊断。尽管在微分子已有技术中已经披露了在应用自旋标记的情况下应用ESR-频谱对转移过程进行研究，但由于设备费用高昂并且对信号的分析复杂和不可靠，所以这种测试方法迄今还不能广泛地应用于临床常规检查。在SU 1319705A1中披露了一种用于诊断恶性肿瘤的方法，其中利用ESR对血浆或血清对自旋探针的键合能力进行测定。测定键合系数α，所述键合系数系峰值A振幅与峰值B振幅的比。当α＞1时，则涉及癌症。当α＜1时，则受检者是健康的。所述方法的缺点是，该方法的灵敏度不够并因而不能提供可靠的诊断。对这种方法的调查表明，在初期患病阶段的虚-阳性和虚-阴性的诊断结果为≥30％。EP0973043A1中披露了一种用于在血清中诊断恶性肿瘤的方法，其中在白蛋白的三个键合点测定一种表示自旋标记的脂肪酸的自旋试剂的自旋试剂的转移率的物理化学参数。白蛋白是血液的转移系统中的主要成分，该成分将实现脂肪酸、色氨酸、胆红素、钙、类骨醇激素和其它对功能重要的活性物质向目标细胞的运送并且其中也参与多种毒素(其中也包括内源)的键合和分布。白蛋白是一种具有很大的对外源(药品)和内源物质键合能力的多肽(分子量68.000)。其由585氨基酸构成，所述氨基酸通过二氧化硫键被设置在一环结构内。在文献中对血清白蛋白上的各种键合点进行了区分。就脂肪酸而言，在白蛋白分子中有所谓的键合点1、2和3。在采用EP0973043A1的诊断方法时是否患有癌症是根据自旋探针的键合参数是否偏离健康的受检者具有的值确定的。即采用根据EP-0973043A1的ESR-方法测定的是血液中的白蛋白的具体的天然的形态，当患有癌症时，该形态将出现对应于健康受检者的形态的变化。经证明当存在血液中作用于白蛋白的附加的影响时，例如血脂值高、服用了药物或自旋探针溶剂的影响或由于在空气环境中对血液样品的保存，采用这种方法将得出虚-阳性或虚-阴性的结果。本专利技术的目的在于提出一种用于进行对含有白蛋白的样品，尤其是血液样品的ESR-频谱测定的费用低廉和快速的方法，该方法在考虑到所述的影响对白蛋白形态的诊断结果是正确和可再现的并适用于临床-化学实验实践。该方法应能实现对人体和动物体内的生理或病理变化的早期诊断和/或监视，对含有白蛋白的材料，特别是库存的血液进行质量检查，并对白蛋白分子的解毒能力进行判定。本专利技术的方法还在于提出一种有益的实施本方法的设备。本专利技术的实现方案是利用ESR-频谱对待检样品中的白蛋白的转移特性的变化进行测定，其中利用极性试剂附加相应的自旋探针感应出待检样品中的目标的形态变化。经证明利用白蛋白形态的生物物理参数与自旋探针在特异性的白蛋白的已知的键合点键合的采用ESR测定的参数相关并可对人体或动物体上或也包括输血-或移植医学制剂中的生理或病理的变化得出最后可靠的结论。根据本专利技术，对样品等份添加三种，优选达八种不同浓度的一种与白蛋白键合的自旋探针和附加至少三种不同浓度的一种极性试剂，借助掺加有自旋探针和极性试剂的样品等份的ESR-频谱，利用对ESR-频谱的计算机模拟测定根据自旋探针浓度和极性试剂的浓度的自旋探针的键合参数的变化并且根据对不同的浓度的自旋探针和极性试剂诱导的白蛋白的形态的自旋探针的键合参数值的变化计算出白蛋白的转移特性的变化，其中对有待添加的自旋探针的浓度进行选择，使自旋探针浓度与白蛋白浓度的比的平均值为2.5±0.5并且根据该平均值至少选出两种附加的浓度，所述浓度与该平均值的偏差不得少于1.0。选择的添加的极性试剂的浓度应使极性试剂在样品等份中的最终浓度为(0.6±0.25)·Cp，其中Cp为极性试剂的临界浓度，超过该临界浓度时将会导致白蛋白变性，并且以该平均值为基础至少选出两个极性试剂的浓度，所述浓度与该平均值的偏差至少为15％。其中在给定的浓度范围内选出添加给某个样品等份的自旋探针和极性试剂的浓度，使其中至少一个等份内具有较少的探针浓度和较少的极性试剂浓度，至少在一个等份内具有较大的自旋探针浓度和较大的极性试剂浓度，并且至少在一个等份内具有中值的探针浓度和中值的极性试剂浓度(3-频谱-筛选-分析)。优选还可以选择其它的浓度，在至少一个等份内具有较大的自旋探针浓度和较小的极性试剂浓度，并且特别优选的是在至少一个等份内具有较小的探针浓度和较大的极性试剂浓度(8-频谱-分析)。通过该浓度组合可以保证检测出在不同段内的白蛋白的转移特性，即在与疏水的化合物，例如脂肪酸键合时的生理状态(较小的探针浓度和较小的极性试剂浓度)、在血管系统中疏水化合物转移时的生理状态(较大的探针浓度和较小的极性试剂浓度)和在向靶细胞交出(卸载)疏水化合物时的生理特性(较大的探针浓度和较大的极性试剂浓度)。根据SU1319705仅可以测定在天然状态的血浆或血清的键合系数并且根据EP 0 973 043 A1仅测定在被检血液样品中的白蛋白的具体的天然状态，而本专利技术的方法可以检测在极性试剂作用下白蛋白随的时间变化(形态转移特性)和随之的白蛋白的功能和白蛋白基质的键合参数的变化。由于这些变化可以在早期例如由于病理过程，例如癌变、由于医学治疗、由于吸毒、由于血浆组分的分离步骤和对血浆衍生物储存不当而造成的，所以根据本专利技术可以在白蛋白功能变化的早期阶段做出诊断结论。根据用于ESR-分析的介质的物理-化学特性，在血样中将改变白蛋白的形态并随之改变白蛋白系列基质的键合特性。本专利技术的方法的特征还在于，利用ESR-频谱测定白蛋白，例如血液中的白蛋白的转移特性的变化(白蛋白功能)，其中在各种浓度的自旋探针存在的情况下，各种浓度的极性试剂将导致白蛋白分子有针对性的形态变化。优选建立在轴向各向异性的哈密顿函数基础上的数学模型对被各等份记录的频谱进行模拟，对实验频谱和模拟频谱进行比较并通过电子方式计算出在白蛋白的特异自旋探针键合点上的自旋探针的键合参数，优选通过这些键合点相对应的模型和实验测定的ESR-频谱的频谱值的差的平方最小化，其中将求出的自旋探针的键合的参数与白蛋白形态的生理参数相关并且分别视根据求出的参数的待诊断的生理或病理变化选出特异的参数并根据这些参数利用鉴别函数电子计算出作为判断标准的白蛋白形态的特异变性，即对在特异的病理和生理变化时白蛋白的形态的判决标准的极限值。根据本专利技术可以采用一种与白蛋白可以产生特异键合的化合物作为自旋探针，尤其是具有自旋标记的脂肪酸、类固醇激素或者杂环碳氢化合物。而且用作为已知自旋探针的硝酰基加以标记的疏水化合物也可以在本专利技术方法中采用。在本专利技术的特别优选的实施方式中采用16-、5-、7-或12-脱氧-硬脂酸。在采用自旋标记的脂肪酸作为自旋探针时，可对在白蛋白的键合点1、2和3的自本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于对含有白蛋白样品的白蛋白的白蛋白的转移特性的变化的ＥＳＲ－频谱测定的方法，其中对等份的样品添加三种不同浓度的一种与白蛋白键合的自旋探针和附加至少三种不同浓度的一种极性试剂，在待检测的样品中诱导产生白蛋白分子的有针对性的形态变化，借助掺加有自旋探针和极性试剂的等份样品的ＥＳＲ－频谱，利用对ＥＳＲ－频谱的计算机模拟，测定根据自旋探针浓度和极性试剂的浓度的自旋探针的键合参数的变化并且由不同的浓度的自旋探针和极性试剂诱导的白蛋白的形态状态，根据自旋探针的键合参数值的变化计算出白蛋白的转移特性的变化，其中对有待添加的自旋探针的浓度进行选择，使自旋探针浓度与白蛋白浓度的比的平均值为２．５±０．５并且根据该平均值至少选出两种附加的浓度，所述浓度与该平均值的偏差不得少于１．０，并且选择的添加的极性试剂的浓度应使极性试剂的最终浓度为（０．６±０．２５）.Ｃｐ，其中Ｃｐ为极性试剂的临界浓度，超过该临界浓度时将会导致白蛋白变性，并且以该平均值为基础至少选出两个极性试剂的浓度，所述浓度与该平均值的偏差至少为１５％，其中在给定的浓度范围内选出添加给样品等份的自旋探针和极性试剂的浓度，使其中至少一个等份内具有较少的探针浓度和较少的极性试剂浓度，至少在一个等份内具有中值极性试剂浓度和中值探针浓度并且至少在一个等份内具有较高的探针浓度和较高的极性试剂浓度。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：伏拉迪米尔姆拉夫斯基，亚利山大米卢亭，格尔特A马休斯，京特塞伯特，
申请(专利权)人：EW商贸和咨询有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]