一种预防人和动物弓形虫病的蛋白混合疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种预防人和动物弓形虫病的混合蛋白疫苗。本发明专利技术所要保护的一个技术方案是一种免疫原性组合物，所述组合物的活性成分为弓形虫重组蛋白14‑3‑3、MIF和CDPK3组成的重组蛋白混合物。本发明专利技术的实施例中将弓形虫重组蛋白14‑3‑3、MIF和CDPK3混合得到的重组蛋白混合物免疫BALB/c小鼠，发现使用该重组蛋白免疫可有效地增强体液免疫和细胞免疫反应，明显延长弓形虫RH株感染小鼠的存活时间，显著降低弓形虫PRU慢性感染中脑包囊数目，取得了良好的免疫效果。使用该重组蛋白制备的疫苗可作为预防弓形虫急、慢性感染有效候选疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种预防人和动物弓形虫病的蛋白混合疫苗
本专利技术涉及医学生物
，具体涉及一种预防人和动物弓形虫病的蛋白混合疫苗。
技术介绍
弓形虫病(Toxoplasmosis)是由弓形虫引起的一种人兽共患寄生虫病。弓形虫在正常人体多为隐性感染，不会有明显的症状，而在免疫力低下或免疫缺陷的人群，如长期化疗的癌症患者、AIDS患者和器官移植者，会引起严重的并发症，严重危害人类健康。怀孕早期感染弓形虫会导致胎儿感染，可导致流产、早产、胎儿畸形和死胎等，影响优生优育。14-3-3蛋白是广泛存在于酵母、植物、蠕虫、原虫、昆虫和人类的一组高度保守的蛋白质家族。研究表明，14-3-3蛋白参与细胞信号转导、细胞分化和凋亡等体内多种重要的细胞生命活动的调节过程。弓形虫14-3-3(Tg14-3-3)是胞浆信号转导蛋白，因为在不同毒力株的有性生殖阶段和无性生殖阶段均可自cDNA文库中筛选出Toxo14-3-3编码基因，推测其存在于弓形虫的各个不同发育阶段。此外，Tg14-3-3还可由虫体分泌并定位于弓形虫纳虫泡中，是弓形虫分泌抗原的一员。巨噬细胞移动抑制因子(Macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)是哺乳动物体内一种具有互变异构酶和氧化还原酶活性的促炎因子。在很多的寄生虫中均有MIF的同系物的表达，并且参与了宿主免疫应答。通过序列比对，发现弓形虫来源的MIF蛋白(TgMIF)和哺乳动物MIF仅有26％的同源性[1]。钙离子作为一种重要的第二信使，可引起细胞内多种特异性应答。在顶复门原虫中，Ca2+浓度的变化调控着下游的效应分子，影响着寄生虫入侵、逸出宿主细胞、在宿主体内移行等多个过程。钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependentproteinkinases，CDPKs)是一类接收并传导胞外Ca2+信号的效应分子，是一种丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。研究发现，CDPKs主要参与寄生虫对宿主细胞的粘附、入侵、逸出以及蛋白的分泌等多个过程。在弓形虫急性感染期，可用化学药物(乙胺嘧啶、磺胺嘧啶等)控制，但无法消除弓形虫慢性感染，接种疫苗被认为可以有效的预防和控制寄生虫感染。目前，已经开发出灭活和减毒的疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗以及重组蛋白疫苗等用来预防弓形虫感染。目前唯一用于商业上的减毒活疫苗是来自弓形虫S48菌株的减毒速殖子，仅被用于预防绵羊流产的发生[2]。此外，基因修饰的弓形虫，如尿嘧啶营养缺陷型突变体，已被实验证明具有疫苗的作用[3-6]。然而，这些基因突变弓形虫疫苗有一定几率恢复为新型的致病虫株，不适合人类使用，因而研制有效的弓形虫疫苗刻不容缓。参考文献1.SommervilleC,RichardsonJM,WilliamsRA,MottramJC,RobertsCW,AlexanderJ,HenriquezFL(2013)BiochemicalandimmunologicalcharacterizationofToxoplasmagondiimacrophagemigrationinhibitoryfactor.TheJournalofbiologicalchemistry288(18):12733-12741.doi:10.1074/jbc.M112.419911.2.BuxtonD,InnesEA(1995)Acommercialvaccineforovinetoxoplasmosis.Parasitology110Suppl:S11-16.doi:10.1017/s003118200000144x.3.FoxBA,BzikDJ(2002)DenovopyrimidinebiosynthesisisrequiredforvirulenceofToxoplasmagondii.Nature415(6874):926-929.doi:10.1038/415926a.4.FoxBA,BzikDJ(2010)Avirulenturacilauxotrophsbasedondisruptionoforotidine-5'-monophosphatedecarboxylaseelicitprotectiveimmunitytoToxoplasmagondii.Infectionandimmunity78(9):3744-3752.doi:10.1128/IAI.00287-10.5.FoxBA,BzikDJ(2015)Nonreplicating,cyst-defectivetypeIIToxoplasmagondiivaccinestrainsstimulateprotectiveimmunityagainstacuteandchronicinfection.Infectionandimmunity83(5):2148-2155.doi:10.1128/IAI.02756-14.6.XiaN,ZhouT,LiangX,YeS,ZhaoP,YangJ,ZhouY,ZhaoJ,ShenB(2018)ALactateFermentationMutantofToxoplasmaStimulatesProtectiveImmunityAgainstAcuteandChronicToxoplasmosis.Frontiersinimmunology9:1814.doi:10.3389/fimmu.2018.01814.
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何预防弓形虫病或如何制备稳定有效的预防人和动物感染弓形虫病的疫苗。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物为免疫原性组合物A或免疫原性组合物B。本专利技术所提供的免疫原性组合物A的活性成分为由弓形虫的重组蛋白14-3-3、弓形虫的重组蛋白MIF和弓形虫的重组蛋白CDPK3组成；免疫原性组合物B的活性成分为由所述弓形虫的重组蛋白14-3-3和所述弓形虫的重组蛋白CDPK3组成。所述弓形虫的重组蛋白14-3-3是如下A1)、A2)、A3)或A4)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质，A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第37-302位的蛋白质，A3)在A1)或A2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，A4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；所述弓形虫重组蛋白MIF蛋白是如下B1)、B2)、B3)或B4)的蛋白质：B1)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质，B2)氨基酸序列是序列表中序列3的第35-150位的蛋白质，B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质，B4)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫原性组合物，其特征在于：所述免疫原性组合物为免疫原性组合物A或免疫原性组合物B；/n所述免疫原性组合物A的活性成分为由弓形虫的重组蛋白14-3-3、弓形虫的重组蛋白MIF和弓形虫的重组蛋白CDPK3组成；/n所述免疫原性组合物B的活性成分为由所述弓形虫的重组蛋白14-3-3和所述弓形虫的重组蛋白CDPK3组成；/n所述弓形虫的重组蛋白14-3-3是如下A1)、A2)、A3)或A4)的蛋白质：/nA1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质，/nA2)氨基酸序列是序列表中序列1的第37-302位的蛋白质，/nA3)在A1)或A2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，/nA4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；/n所述弓形虫重组蛋白MIF是如下B1)、B2)、B3)或B4)的蛋白质：/nB1)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质，/nB2)氨基酸序列是序列表中序列3的第35-150位的蛋白质，/nB3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质，/nB4)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由B1)或B2)衍生的或与B1)或B2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；/n所述弓形虫重组蛋白TgCDPK3蛋白是如下C1)、C2)、C3)或C4)的蛋白质：/nC1)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质，/nC2)氨基酸序列是序列表中序列5的第35-571位的蛋白质，/nC3)在C1)或C2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质，/nC4)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由C1)或C2)衍生的或与C1)或C2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。/n...

【技术特征摘要】
1.一种免疫原性组合物，其特征在于：所述免疫原性组合物为免疫原性组合物A或免疫原性组合物B；
所述免疫原性组合物A的活性成分为由弓形虫的重组蛋白14-3-3、弓形虫的重组蛋白MIF和弓形虫的重组蛋白CDPK3组成；
所述免疫原性组合物B的活性成分为由所述弓形虫的重组蛋白14-3-3和所述弓形虫的重组蛋白CDPK3组成；
所述弓形虫的重组蛋白14-3-3是如下A1)、A2)、A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质，
A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第37-302位的蛋白质，
A3)在A1)或A2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
A4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；
所述弓形虫重组蛋白MIF是如下B1)、B2)、B3)或B4)的蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质，
B2)氨基酸序列是序列表中序列3的第35-150位的蛋白质，
B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质，
B4)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由B1)或B2)衍生的或与B1)或B2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；
所述弓形虫重组蛋白TgCDPK3蛋白是如下C1)、C2)、C3)或C4)的蛋白质：
C1)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质，
C2)氨基酸序列是序列表中序列5的第35-571位的蛋白质，
C3)在C1)或C2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质，
C4)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由C1)或C2)衍生的或与C1)或C2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。


2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述免疫原性组合物A中，所述弓形虫的重组蛋白14-3-3、弓形虫的重组蛋白MIF和弓形虫的重组蛋白CDPK3的质量比为1:1:1；
所述免疫原性组合物B中，所述弓形虫的重组蛋白14-3-3和弓形虫的重组蛋白CDPK3的质量比为1:1。


3.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述免疫原性组合物为下述任一种产品：
F1、治疗和/或预防和/或辅助治疗弓形虫感染的产品；
F2、提高弓形虫感染后宿主免疫应答能力的产品；
F3、降低弓形虫感染引起的宿主致死率的产品；
F4、减少弓形虫感染导致的宿主脑包囊产生的产品。


4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述治疗和/或预防和/或辅助治疗弓形虫感染的产品为用于弓形虫感染预防的疫苗，所述用于弓形虫感染预防的疫苗含有佐剂。


5.权利要求1-4中任一权利要求所述的免疫原性组合物的制备方法，包含如下步骤：制备所述弓形虫的重组蛋白14-3-3、所述弓形虫的重组蛋白MIF和所述弓形虫的重组蛋白CDPK3，将所述弓形虫的重组蛋白14-3-3、所述弓形虫的重组蛋白MIF和所述弓形虫的重组蛋白CDPK3混合作为所述免疫原性组合物的活性成分，得到所述的免疫原性组合物；
所述弓形虫的重组蛋白14-3-3按照包括如下步骤的方法制备：使所述弓形虫的重组蛋白14-3-3的编码基因在原核微生物中进行表达得到所述弓形虫的重组蛋白14-3-3；
所述弓形虫的重组蛋白MIF按照包括如下步骤的方法制备：使所述弓形虫的重组蛋白MIF的编码基因在原核微生物中进行表达得到所述弓形虫的重组蛋白MIF；
所述弓形虫的重组蛋白CDPK3按照包括如下步骤的方法制备：使所述弓形虫的重组蛋白CDPK3的编码基因在原核微生物中进行表达得到所述弓形虫的重组蛋白CDPK3。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述弓形虫的重组蛋白14-3-3的编码基因为如下a1)、a2)或a3)所示的基因：
a1)编码链的编码序列是序列2所示的DNA分子；
a2)编码链的编码序列是序列2的第109-909位所示的DNA分子；
a3)与...

【专利技术属性】
技术研发人员：都建，安然，陈滢，温红阳，吴敏敏，闫奇，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34